[发明专利]一种重组茯苓免疫调节蛋白WCFIP1及其抗体的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及应用重组DNA技术生产重组WCFIP1蛋白的生物技术，并利用该重组蛋白免疫小鼠，通过制备抗血清、硫酸铵分级沉淀制备了高质量的抗体。具体来说涉及一种WCFIP1重组蛋白及其抗体的制备方法。

背景技术

茯苓是中国的道地、大宗药材。茯苓因其性平、味苦、无毒，具有渗湿利水、防癌抗衰、增强机体免疫力的功效，被称为中国的四大原料药之一，临床中药处方中65%都有茯苓，也是当前国际药品市场最具潜力的天然药物之一。同时被国家卫生部、国家中药管理局列入“既是食品又是药品的品种名单”。 茯苓中的主要成分为膳食纤维，其比例占茯苓干重的80%以上；其次为蛋白质，约占茯苓干重的1.5%。目前，对茯苓活性成分的研究主要集中在非蛋白类的次生代谢产物上。茯苓有效成分的研究中，研究得最多的就是茯苓多糖，即茯苓次聚糖，它具有抗肿瘤活性，其衍生物羧甲基茯苓糖已被证明具免疫促进及抗肿瘤作用，而U-茯苓多糖和羟乙基茯苓多糖则可抑制小鼠肉瘤细胞生长、调节免疫系统功能；其次是茯苓的三萜类化合物，可抑制癌细胞增生，目前的研究发现茯苓三萜类化合物还具有抗炎、抗肿瘤细胞生成及诱生集落刺激因子等作用。目前，对占茯苓干重1.5%的茯苓蛋白的研究几乎没有报道。

国立台湾大学的研究者从茯苓干燥菌核中经由阴离子交换树脂与胶体过滤层析纯化得到新免疫调节蛋白 PCP。体外试验显示该茯苓蛋白 PCP 能刺激 RAW 264.7 巨噬细胞产生 TNF-α 与 IL-1β，同时亦能调控 NF-κB 相关基因的表现量。最近，台湾大学的研究者又发现了一种分子量大约为15 kDa的另一种免疫调节单体蛋白，该蛋白被命名为WCFIP1，但还尚未对其具体功能进行详细研究。因此，对茯苓重要功能蛋白的研究将进一步增加茯苓及其产品的应用开发价值，为整个茯苓及其制品产业的开发提供新的思路和新的产品。同时，检测该蛋白的相应抗体的制备将有利于该蛋白的检测分析。建立可以大量生产WCFIP1的技术将为茯苓蛋白类活性成分的应用开发开创一个崭新局面。因此，WCFIP1重组蛋白极具开发价值。

发明内容

基于此，本发明提供一种重组WCFIP1蛋白及其高效表达、纯化和制备方法，该方法首次利用重组载体pET28和表达宿主大肠杆菌BL21菌株，实现了WCFIP1的表达。利用镍亲合层析可以快速将蛋白从细胞裂解液中分离出来，获得高纯度的WCFIP1包涵体蛋白。将该蛋白与弗氏完全佐剂混合至完全乳化，将乳化的抗原免疫昆明小鼠，在2次加强免疫后的第2周取小鼠的血液，并制备血清。在测定抗血清的效价后，分别利用50%和33%的硫酸铵进行分级沉淀和透析处理，初步分离纯化抗血清。以经IPTG诱导可以表达WCFIP1蛋白的大肠杆菌表达菌菌体总蛋白为检测对象，对纯化抗体的特异性进行分析，蛋白质印迹结果表明，通过上述方法制备的抗体具有很高的特异性。解决上述问题的技术方案如下：

WCFIP1重组蛋白的生产方法，主要包括以下步骤：

（1）合成WCFIP1基因：根据WCFIP1成熟蛋白的氨基酸序列，人工合成了该蛋白的DNA序列，其序列如下：5’-GTCAACGTGACCTACGACCCTTTCTTCGACAATCCTAATAATTC TCTTTCATACGTTGCTTGCTCAGATGGAACTAATGGACTTCTTACCAAGGGTTACACTACTTTGGGTTCACTTCCAGATTTTCCTTACATTGGTGGAGCATATGCTATCGCCGGTTGGAACTCTCCATCCTGTGGAACCTGCTGGGAATTGACTTACAACAACGTTTCTATTAATATCCTTGGTACTGACACAGCTGCCGGATTCAACATTGCTTTGACAGCTATGAATGTCCTTACTAATAACGCCGCAGTTGATTTGGGAGAAGTTGACGCCGCCGCCATTCAGGTTGACTCTTCAGTCTGTGGTTTG-3’，合成的基因克隆至pUC载体；

（2）WCFIP1成熟基因的克隆：以合成的基因为模板，用特异引物扩增出完整WCFIP1基因片段，所用WCFIP1特异引物中引入BamH                                                酶切位点和Hind酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得重组质粒WCFIP1/pMD20-T，经过测序确定为读码框正确的重组载体；