[发明专利]一种快速测定胰蛋白酶和抑肽酶结合机制的方法

摘要

本发明是公开一种快速测定胰蛋白酶和抑肽酶结合机制的方法，设计一种利用包括荧光猝灭和同步荧光在内的荧光光谱法，来研究抑肽酶对胰蛋白酶的猝灭机制，二者的结合常数K以及结合位点数n。是在选取适合比例的胰蛋白酶和抑肽酶混合液，在28～37℃温度下，在其相应的激发波长下，测定不同浓度抑肽酶对胰蛋白酶的猝灭作用，结合Stern-Volmer曲线，进一步求出二者的结合常数K以及结合位点数n，进而得知二者的作用机制，能够为从分子水平上研究抑制剂及其他小分子猝灭剂与蛋白质的相互作用提供一种方便、精确、有效的方法。

主权项

一种快速测定胰蛋白酶和抑肽酶结合机制的方法，其特征在于：至少包括以下步骤：第一步：胰蛋白酶浓度和抑肽酶浓度及其比例的选择所述的胰蛋白酶浓度和抑肽酶浓度，是使其在最适激发波长下的最大荧光强度应小于1000，并且加入不同浓度的抑肽酶，对胰蛋白酶的猝灭效应显著且与猝灭剂的浓度呈正相关，选用2.6×10‑6～2.34×10‑5mol/L的抑肽酶作为猝灭剂，酶浓度为2×10‑6mol/L，结果显示抑肽酶对胰蛋白酶的猝灭效果显著；第二步：热处理参数的控制选取18～37℃为水浴加热的温度条件为酶与抑制剂反应提供不同的温度环境，热处理时间选取30min～150min为不同反应时间，分别测定抑肽酶对胰蛋白酶的猝灭程度；第三步：荧光猝灭参数的调控选用胰蛋白酶的激发波长为280～283nm,发射波长为260～600nm，激发和发射的狭缝宽度为5nm；第四步：同步荧光参数的调控分别选取△λ=15nm和△λ=60nm，其余条件同荧光猝灭来测定加入不同浓度抑制剂后的混合液的荧光强度；第五步：荧光生色基团的判断通过测定加入不同浓度抑制剂后△λ=15nm和△λ=60nm的同步荧光，依据荧光强度的变化情况，判断影响荧光强度的主要生色基团为酪氨酸；第六步：猝灭机制的判断第七步：结合常数K和结合位点数n的计算所述的结合常数K和结合位点数n的计算，是选取18～37℃下不同抑制剂对胰蛋白酶的荧光猝灭效应，作荧光强度对抑制剂强度的Stern‑Volmer曲线，进一步求出结合常数为105L/mol以上，结合位点数n约为1。