[发明专利]豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR的检测方法

摘要

本发明公开了一种豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR的检测方法，它由如下步骤组成：A、样本的准备：拔取牙齿，低温冷冻脆化处理24～48 h；B、设计引物，C、提取总RNA：D、反应体系的建立，E、反应条件的优化，F、标准曲线的制作，G、荧光定量分析。本方法可用于批量进行切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR检测。本发明具有操作简单、污染小、敏感性高、特异性强、重复性好、精确度高的优点。

主权项

一种豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR的检测方法，其特征在于：它由如下步骤组成：A、样本的准备：快速拔取牙齿，除净附着的牙龈组织，以4℃灭菌生理盐水反复冲洗，用灭菌滤纸吸干，迅速将牙齿用灭菌咬骨钳截成小块，放入液氮中进行低温冷冻脆化处理24～48 h；B、设计引物：根据Genbank中豚鼠的β‑actin基因和大鼠的DSPP基因的mRNA序列设计相应的引物，β‑actin基因扩增时使用的引物为：上游引物：5’‑AGCAGATGTGGATCAGCAAG‑3’下游引物：5’‑AAGGGTGTAACGCAGCAAAG‑3’DSPP基因扩增时使用的引物为：上游引物：5’‑GTTAGTGCCGCTGGAGAGAG‑3’下游引物：5’‑ATCGTCGTTAGTGGCGTTG‑3’C、提取总RNA：从液氮中取牙齿小块150～200 mg，进行液氮研磨，一般研磨14～16 min；收集研磨好的牙齿组织粉末，加入到预先加有1 ml裂解液的预冷5 ml离心管中，在冰浴下以转速3000 r/min进行间歇性匀浆2～3 min；转入2.0 ml的离心管中，25℃温浴静置5 min；加入0.2ml氯仿，在旋涡振荡器上旋涡振荡15 s，25℃温浴静置3 min；在4℃下以12000 g离心15 min；收集上清，加入0.5 ml异丙醇，25℃温浴静置10 min；在4℃下以12000 g离心10 min；弃去上层悬液，加入1 ml 75%乙醇溶液，旋涡振荡洗脱，在4℃下以7500 g离心5 min；弃上清，干燥RNA沉淀5～10 min，加入10 µl的0.1%DEPC处理水，于55～60℃下进行加热10 min，分装后保存于－80℃；D、反应体系的建立：RT‑PCR反应体系组成包括：总RNA模板、上下游引物、Buffer、反转录酶、荧光染料；建立20 µl的反应体系；E、反应条件的优化：参照引物的TM值，通过扩增曲线和熔解曲线分析，确定最佳的引物浓度、退火温度和时间以及总RNA模板添加量；本发明采用的反应条件为：95℃预变性10 s，95℃变性5 s，58℃退火20 s，72℃延伸6 s；共40个循环；F、标准曲线的制作：用RNase Free超纯水将总RNA稀释到0.2  μg/μl，作为浓度最高的模板（20，1号）。然后取11个容量为150 μl的EP联管（2‑12号），分别加入10 μl RNase Free超纯水。从1号中取10 μl加入到2号管中，稀释倍数为2，依次类推；将1号逐级2倍稀释成2‑1、2‑2、2‑3、2‑4、2‑5、2‑6、2‑7、2‑8、2‑9、2‑10、2‑11，用于标准曲线的制作；G、荧光定量分析：针对看家基因和目的基因，每个样本在每次反应中，要至少做3次重复，取平均值，根据Ct值，从标准曲线上读取相应的模板浓度；样本目的基因的相对表达量等于目的基因的表达量均值除以看家基因表达量均值。