[发明专利]一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法

摘要

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法, 属疫苗质量监测技术领域。本发明方法包括特异性引物及Taqman荧光探针的设计、RNA提取、cDNA制备、标准质粒构建、Taqman荧光定量PCR检测标准曲线的建立、有效性验证和结果判定。设计合成了两对引物，均能特异性扩增猪瘟兔化弱毒病毒的cDNA，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增产物大小为197bp，用于构建标准浓度的质粒，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4扩增产物大小为143bp，包含于前述扩增产物197bp之内,加入荧光探针SEQ ID NO.5用于Taqman荧光定量RT-PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量。本发明方法检测灵敏度高，检测时间短，能同时进行大批量的样本分析，具有良好的敏感性、特异性、重复性，适用于各品牌猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的测定。

主权项

一种荧光定量RT‑PCR检测猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量的方法，包括用于实时荧光定量RT‑PCR检测猪瘟病弱毒疫苗病毒含量的特异性引物、标准质粒的制备及建立标准曲线、确定实验的成立标准、确定阳性或阴性的判定标准，其具体特征如下： （1）引物特征：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2能特异性扩增猪瘟兔化弱毒疫苗病毒的cDNA，扩增产物大小为197bp，用于构建标准浓度的质粒；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4能特异性扩增包含于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2扩增产物片段之内的猪瘟兔化弱毒疫苗病毒cDNA，扩增产物大小为143bp，SEQ ID NO：5为Taqman荧光探针，在其5’端标记报告荧光基团FAM，3’标记猝灭荧光基团TAMRA，用于建立荧光定量PCR标准曲线及检测未知样品；（2）标准曲线的建立方法：提取猪瘟兔化弱毒疫苗的RNA，并反转录为cDNA，作为模板；以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物，进行PCR扩增；将扩增产物纯化回收，连接到pMD19‑T载体上，转化到感受态细胞DH5α内，提取质粒DNA，获得猪瘟兔化弱毒疫苗检测用的标准浓度质粒；将制备的标准质粒作10倍梯度稀释，以稀释液为模板，进行荧光定量PCR，采集荧光信号，使用Bio‑Rad iQ5软件绘制出实时荧光定量标准曲线，并获得其产物Tm值；（3）实验成立标准：若阳性对照的Ct值＜32，阴性对照的Ct值＞35，电脑绘制的标准曲 线各点相关度大于95%，反应效率在80%～120%之间，则说明实验数据准确、有效，实验成立；（4）判定阳性或阴性的标准：在实验成立的前提下，待测样品的Ct值＜35，判为阳性；待测样品的Ct值＞35则判为阴性。