[发明专利]一种大规模合成长链RNA药物的生产新工艺

摘要

本发明提供了一种大规模合成长链RNA药物的生产新工艺，其特征在于，具体步骤包括：DNA转录模板设计；模板制备、纯化；体外转录；产物纯化、纯度检测等步骤。本发明生产工艺尤其适用于合成具有稳定二级结构的长链RNA药物，本发明工艺操作简单、成本低，满足大规模生产的要求，生产的长链RNA药物可以用于细胞实验、动物实验等临床前RNA药物功能研究。

主权项

一种大规模合成长链RNA药物的生产新工艺，其特征在于，具体步骤包括：第一步：设计双链DNA转录模板：所述的双链DNA转录模板由正义链和反义链组成，其中正义链由T7启动子序列和连接在T7启动子序列后的与长链RNA药物序列一致的DNA序列组成，反义链是与正义链序列完全互补的DNA序列；根据上述设计的双链DNA转录模板设计两条DNA引物，其中正向引物的序列与DNA转录模板正义链从5’端起始的一部分的序列相同，反向引物为的序列与DNA转录模板反义链从5’端起始的一部分的序列相同；正向引物3’端序列和反向引物3’端序列之间至少有10个连续碱基完全反向互补；第二步：模板制备：化学合成得到第一步中的两条DNA引物，按摩尔数比1∶1混合后退火形成不完全互补双链；在pfu DNA聚合酶的作用下补平后形成第一步中的双链DNA转录模板；所述的双链DNA转录模板由双链RNA聚合酶启动子序列和连接在双链RNA聚合酶启动子序列后的与长链RNA药物序列对应的DNA序列两部分组成；第三步：模板纯化：将第二步得到的双链DNA转录模板用异丙醇沉淀，然后用乙醇洗涤后用无内毒素水溶解，得到纯化后的双链DNA转录模板；第四步：体外转录：将第三步所得的纯化后的双链DNA转录模板在RNA聚合酶的作用下，以三磷酸核苷混合物为原料，进行体外转录，在双链RNA聚合酶启动子序列的引导下，转录出长链RNA药物；第五步：RNA产物纯化：将第四步得到的长链RNA药物使用阴离子交换色谱柱在高压液相色谱仪上直接纯化，线性梯度洗脱，将收集的长链RNA药物在凝胶过滤色谱柱上进行脱盐处理；收集长链RNA药物并冷冻干燥，获得纯化后的长链RNA药物；第六步：纯化后RNA纯度检测：将第五步所得的长链RNA药物进行琼脂糖或聚丙酰胺凝胶电泳检测、HPLC分析检测、内毒素残留检测、DNA残留检测以及蛋白残留检测中的至少一种。