[发明专利]多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

摘要

本发明公开了一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，包括含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒包装、小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备、MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞、小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞。本发明方法简便、易操作、效果好。

主权项

一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征是：包括下列步骤：（一）含目的基因PDX‑1，NeuroD，MafA腺病毒包装（1）转染前质粒的准备1.1  重组质粒Pac I单酶切，37℃酶切2h；1.2  采用经典酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质粒浓度；（2）转染2.1取处于对数生长期的293A细胞，用0.05%胰酶消化，细胞计数后，按照每孔4.5×105个细胞，种于6孔板，37℃，5%CO2 的培养箱中培养过夜；2.2第二天转染前移去培养液，换2ml Opti‑MEM培养液；2.3取2µg线性化的质粒加入250µl经37℃预热的Opti‑MEM中，混匀；2.4取5µl lipofectamine2000 加入250µl Opti‑MEM中，混匀，室温放置5min；2.5将500µl复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，混匀；在37℃，5％的CO2的培养箱中培养5‑6小时后，换上完全培养液，继续置培养箱中培养；2.6转染后48小时，用0.05%胰酶消化细胞，并转移至10cm培养皿中，加入10ml完全培养基；2.7每2‑3天换入新鲜培养基，观察是否有病变效应出现；2.8让感染继续发生，直至80%细胞出现病变效应；收集细胞及上清液至灭菌的15ml离心管，‑80℃保存；（3）用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来，离心收集初级病毒液；（4）初级病毒液的扩增4.1病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在10cm培养皿中以3×106细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90%；4.2感染时在10cm皿中加入100µl初级病毒液，混匀；4.3在37℃，5％的CO2的培养箱中培养至80‑90%细胞变圆并漂浮；4.4收集细胞至灭菌的15ml离心管； 4.5将收集的细胞置于‑80℃，30分钟，随后置于37℃ 15分钟；反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来；4.6室温下3000rpm离心15分钟，除去细胞碎片；4.7将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1.5ml DMEM培养液中，分装小管，放置于‑80℃保存备用；（二）小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备（1）性成熟C57BL/6J小鼠按1公：2母比例合笼；（2）每天早上观察母小鼠阴道口，有阴道栓确定为怀孕，见栓当天上午定为怀孕的0.5天；（3）取怀孕12.5～13.5天母鼠，断颈处死，取出胎鼠，将胎鼠躯干部分置于一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞；（4）用显微剪将鼠胚躯干剪成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内；（5）室温下静置5分钟，弃上层液，留下胚胎组织碎块；（6）向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入2ml 0.05%胰蛋白酶，轻轻吹吸30秒，静置5分钟后吸出上清于MEF培养基中，反复多次以上操作直至组织块消失；（7）离心后重悬细胞于MEF培养基中，待细胞80%‑90%融合时传代或冻存；（8）在第3～5代MEFs的培养上清中加入丝裂霉素C，使丝裂霉素C的终浓度为10µg/ml，放回培养箱处理2.5小时；（9）将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶内，覆盖培养瓶底面，室温下静置2小时后吸弃明胶水溶液，用PBS洗涤一次；（10）弃含有丝裂霉素C的MEFs培养上清，PBS洗涤5遍；（11）消化经丝裂霉素C处理的MEFs，种植到预先用明胶处理过的培养瓶内，种植的细胞数为6×104个/cm2；（12）待细胞贴壁后进行观察，如细胞过稀则补加细胞，保证细胞能连成一片而没有间隙，为饲养层细胞；（13）将制备好的饲养层细胞放置在培养箱内备用；在5天内使用，使用前要更换培养基为胚胎干细胞培养基；（三）MEFs受染重编程为小鼠iPS细胞 （1）先用0.1%明胶预包被一个T25瓶，包被时间为10分钟；（2）用0.25% trypsin/EDTA消化第三代MEFs，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数，取出1×105个细胞用于感染实验所需的细胞量；（3）将所需的含有目的基因Oct4、Sox2、Klf4、cMyc的慢病毒及表达rtTA的慢病毒加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45µm过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；（4）将1×105的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5µl助转剂polybrene，助转剂polybrene使用浓度为10µg/ml，将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25瓶中，摇匀后放入37°C培养箱中，10小时后去病毒；（5）将上述慢病毒感染后的细胞用0.25% trypsin/EDTA消化下来，按六孔板每孔1×104的细胞量铺到事先准备好的饲养层细胞上；（6）第2天，将MEF培养基换成mESC培养基，继续培养，以后每2天换液一次；（7）细胞长至第13天左右，挑克隆，将mESC样的克隆挑至新的饲养层细胞上，用mESC培养基继续培养，扩增；得到小鼠iPS细胞；（四）小鼠iPS细胞受染分化为胰岛素分泌细胞（1）小鼠iPS细胞用0.25% trypsin/EDTA消化后用mESC培养基重悬于100mm细胞培养皿中，50分钟后吸出上清，用细胞计数板计数；（2）将所需的分别含目的基因PDX‑1，NeuroD，MafA的腺病毒载体Ad‑mPDX‑1‑IRES‑GFP、Ad–mNeuroD‑IRES‑GFP及Ad‑mMafA‑IRES‑GFP加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45µm过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质；（3）将小鼠iPS细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，加入MEF培养基后重悬于超低吸附六孔板中，2ml/孔，让病毒维持在MEF培养基中2天，第4天重复转导胚体一次；（4）6天后收集胚体，用MEF培养基重悬于普通六孔板中；（5）待大量细胞自胚体爬出时消化传代。