[发明专利]多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法。

背景技术

诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）是将成体细胞重编程为具有多分化潜能的干细胞，它在形态学、表观遗传学、全基因表达谱及分化潜能方面与胚胎干细胞（ESCs）极其相似，其优点是个体特异来源的iPS细胞能避免免疫排斥问题。同时iPS细胞生成技术不涉及胚胎毁损等伦理学问题。科学研究等工作中需要多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方法简便、易操作、效果好的多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种多基因修饰iPS细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征是：包括下列步骤：

（一）含目的基因PDX-1，NeuroD，MafA腺病毒包装

（1）转染前质粒的准备

1.1重组质粒Pac I单酶切，37℃酶切2h；

1.2采用经典酚氯仿抽提法对单酶切质粒进行纯化，用紫外分光光度计测定纯化质粒浓度；

（2）转染

2.1取处于对数生长期的293A细胞，用0.05%胰酶消化，细胞计数后，按照每孔4.5×105个细胞，种于6孔板，37℃，5%CO₂的培养箱中培养过夜；

2.2第二天转染前移去培养液，换2ml Opti-MEM培养液；

2.3取2μg线性化的质粒加入250μl经37℃预热的Opti-MEM中，混匀；

2.4取5μllipofectamine2000加入250μl Opti-MEM中，混匀，室温放置5min；

2.5将500μl复合物加入到细胞孔中，摇动培养板，混匀；在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养5-6小时后，换上完全培养液，继续置培养箱中培养；

2.6转染后48小时，用0.05%胰酶消化细胞，并转移至10cm培养皿中，加入10ml完全培养基；

2.7每2-3天换入新鲜培养基，观察是否有病变效应出现；

2.8让感染继续发生，直至80%细胞出现病变效应；收集细胞及上清液至灭菌的15ml离心管，-80℃保存；

（3）用反复冻融法使病毒从细胞中释放出来，离心收集初级病毒液；

（4）初级病毒液的扩增

4.1病毒感染前一天对293A细胞进行计数，在10cm培养皿中以3×10⁶细胞种板，以保证转导时细胞密度达到90%；

4.2感染时在10cm皿中加入100μl初级病毒液，混匀；

4.3在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养至80-90%细胞变圆并漂浮；

4.4收集细胞至灭菌的15ml离心管；

4.5将收集的细胞置于-80℃，30分钟，随后置于37℃15分钟；反复冻融3次使病毒从细胞中释放出来；

4.6室温下3000rpm离心15分钟，除去细胞碎片；

4.7将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1.5ml DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用；

（二）小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养细胞的制备

（1）性成熟C57BL/6J小鼠按1公：2母比例合笼；

（2）每天早上观察母小鼠阴道口，有阴道栓确定为怀孕，见栓当天上午定为怀孕的0.5天；

（3）取怀孕12.5～13.5天母鼠，断颈处死，取出胎鼠，将胎鼠躯干部分置于一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤3次，充分弃除红细胞；

（7）用显微剪将鼠胚躯干剪成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内；

（8）室温下静置5分钟，弃上层液，留下胚胎组织碎块；

（9）向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入2ml0.05%胰蛋白酶，轻轻吹吸30秒，静置5分钟后吸出上清于MEF培养基中，反复多次以上操作直至组织块消失；

（10）离心后重悬细胞于MEF培养基中，待细胞80%-90%融合时传代或冻存；

（11）在第3～5代MEFs的培养上清中加入丝裂霉素C，使丝裂霉素C的终浓度为10μg/ml，放回培养箱处理2.5小时；

（12）将0.1%明胶水溶液吸入培养瓶内，覆盖培养瓶底面，室温下静置2小时后吸弃明胶水溶液，用PBS洗涤一次；