[发明专利]制造人抗凝血酶-III制品的方法

摘要

本专利涉及一种制造人抗凝血酶-III制品的方法，以Cohn低温乙醇法分离血浆蛋白工艺的组分Ⅳ沉淀为原料，经过抽提、压滤、肝素亲和层析、超滤、除菌过滤、冻干等工序以及必要的S/D及干热病毒灭活工艺，最终制备出高纯的抗凝血酶-Ⅲ冻干制品。本方法调整工艺尽可能使其中的AT-Ⅲ溶解；经加入适当保护剂以S/D病毒灭活工艺代替巴氏病毒灭活工艺，减少活性损失，缩短制备时间；并且只需一步肝素亲和层析就可得到高纯度的AT-Ⅲ溶液，再经过超滤、冷冻干燥、干热病毒灭活等步骤，最终制品纯度在95%以上，比活在6.5IU/mg以上，高于欧洲药典及美国药典规定限度3.0IU/mg。

主权项

制造人抗凝血酶‑III制品的方法，其特征是一种从Cohn低温乙醇法分离血浆蛋白工艺组分Ⅳ沉淀中分离纯化人抗凝血酶‑Ⅲ（AT‑Ⅲ）的工艺，具体实施过程如下步骤：（1）、组分Ⅳ沉淀的抽提与处理抽提缓冲液（氯化钠‑柠檬酸钠溶液）与组分Ⅳ沉淀的混合比例为12:1～3:1  m/v；抽提温度为4～36℃；抽提pH为5.5～11，抽提时间为1～2小时；然后在4～20℃温度下，用气动隔膜泵将抽提混合液进行压滤，去除不溶物；将压滤滤出液pH值调至7.2左右，采用10kD超滤膜进行超滤浓缩；（2）、S/D病毒灭活按组分Ⅳ沉淀的抽提与处理步骤最终所得液体体积的10%，加入11% S/D病毒灭活液，在24～25℃搅拌6小时，其中的11%S/D病毒灭活液，用含吐温‑80和磷酸三丁酯TNBP，按每110g吐温‑80和33g TNBP加水至1千克的方法配制；（3）亲和层析以肝素亲和胶为吸附纯化载体，经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到AT‑Ⅲ原液，其中层析温度范围为4～36℃，各步骤液体流速为每小时6～9个柱体积；①平衡：用平衡液对肝素亲和胶进行平衡，平衡液体积不少于4个柱体积；②上样：将S/D病毒灭活步骤最终所得液体泵入层析柱中，通过肝素亲和胶进行吸附；③洗涤：用洗涤液对亲和胶进行洗涤，洗涤液体积不少于8个柱体积，观察在线紫外吸收图谱，至图谱趋于水平时停止洗涤；④洗脱：对肝素亲和胶进行洗脱，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液，即为AT‑Ⅲ原液；（4）、超滤对亲和层析步骤中所得AT‑Ⅲ原液用10kD孔径超滤膜超滤，添加必要的冷冻干燥保护剂，本冷冻干燥保护剂是指甘氨酸，其最终浓度为0.6～1.6%；（5）、除菌过滤（6）、分装（7）、冷冻干燥①分装后的制品常温入柜： ②将隔板温度在40分钟内降至‑40℃，保持3小时；③开启真空泵，真空度控制在7～15Pa；④2小时后将隔板温度升至‑30℃，保持3小时；⑤4小时后隔板温度升至‑20℃，保持6小时；⑥8小时后将隔板温度升至0℃，保持20小时；⑦10小时后将温度升至30℃，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持1小时；⑧真空压塞出柜： （8）、干热病毒灭活干热温度100℃，时间为30min～60min。