[发明专利]制造人抗凝血酶-III制品的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种从人Cohn血浆组分中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ的工艺，属生物制药领域。工艺步骤简洁，只用一步亲和层析，经两步不同的病毒灭活步骤，所得制品安全可靠。主要用来治疗各种原因引起的抗凝血酶-Ⅲ缺乏患者。

背景技术

    人抗凝血酶-Ⅲ（可表示为AT-Ⅲ）为单肽链α糖蛋白，分子量约58kD（千道尔顿），由423个氨基酸组成，是一种多功能丝氨酸蛋白酶抑制剂，在人体血浆中的抗凝作用占整个抗凝作用的70％左右，其半衰期为2.69天，患病时半衰期缩短，其主要在肝脏合成，故在各种肝脏疾病发生时AT-Ⅲ有不同程度的获得性缺乏。AT-Ⅲ制品主要用来治疗先天性遗传性抗凝血酶-Ⅲ缺乏，AT-Ⅲ缺乏症为常染色体显性遗传，据统计，该症在欧美的发生率为0.2%～0.5%。AT-Ⅲ制品还用来治疗获得性抗凝血酶Ⅲ缺乏，见于各种肝病，如肝硬化、重症呷、肝癌晚期等，以及各种病因引起的弥漫性血管内凝血综合症，产科与外科手术等造成的血栓等。

上世纪60～70年代即开始有人报道纯化AT-Ⅲ的工艺，但是仅限于实验室开发。1972年Heimburger et al首次分离并鉴定AT-Ⅲ为a₂单链糖蛋白，但是其回收率较低，大约在2%左右。1974年Maggie Miller-Andersson et al使用肝素亲和胶从血浆中纯化AT-Ⅲ，然后经过DEAE- Sephadex and Sephadex G200层析处理, 其活性回收率为 34%，纯度在90%以上。1979 年,Wicker et al首先叙述了工业规模制备临床用途的AT-Ⅲ浓缩物, 其原料为工业生产丢弃的Cohn 组分IV沉淀。1989年,Hoffman 等报道了大量制备AT-Ⅲ 的方法， 原料为Cohn 氏工艺提取的组分IV, 通过肝素亲和层析与其它蛋白分离，之后, 在 0.5M 枸椽酸钠溶液中将AT-Ⅲ 浓缩物于 60℃加热 10 小时, 以灭活乙肝病毒和其他传染性病毒,再进行二次肝素亲和层析, 成品比活不低于 6.4 IU/mg, 纯度大于 95% ,冷冻干燥后4℃存放 2 年, 仍有 90%以上的生物学活性。1994年, Wytold 等发表了以重溶后Cohn 氏组分IV沉淀为原料, 进行人血浆AT-Ⅲ肝素亲和层析的大规模提纯改良法, 该工艺包括了病毒灭活的加热过程和为进一步提纯目的的第二步肝素亲和层析, 上述方法可在 5 小时内在 40升柱上通过 1800 升的原液。AT-Ⅲ成品纯度达 95%以上, 其平均效率为 69% , 比活性为 7.7 IU/mg 蛋白, 由 20 kg Cohn 氏组分IV沉淀获得30g AT-Ⅲ, 收率可达到15～20%。该法最明显的改进是用Heparin- Hyper D (Sepracor, 硬性硅组成的肝素树指)取代肝素U ltrogel，显著增加了层析容量, 提高了流速, 降低了操作压力。此法的最大特点亦是采用了Cohn 氏组分IV沉淀为AT-Ⅲ 制备原料，便于充分利用原料血浆, 降低成本并对其它血浆蛋白的制备无影响。

发明内容

本发明目的是以Cohn 氏组分IV沉淀为原料，以氯化钠-柠檬酸钠溶液为抽提缓冲液对其融解，调整工艺尽可能使其中的AT-Ⅲ溶解；经加入适当保护剂以S/D病毒灭活工艺代替巴氏病毒灭活工艺，减少活性损失，缩短制备时间；并且只需一步肝素亲和层析就可得到高纯度的AT-Ⅲ溶液，再经过超滤、冷冻干燥、干热病毒灭活等步骤，最终制品纯度在95%以上，比活在6.5 IU/mg以上，高于欧洲药典及美国药典规定限度3.0IU/mg。

发明详述

本发明是一种从Cohn低温乙醇法分离血浆蛋白工艺组分Ⅳ沉淀中分离纯化人抗凝血酶-Ⅲ（AT-Ⅲ）的工艺，具体实施过程如下：

（1）、组分Ⅳ沉淀的抽提与处理

抽提缓冲液（氯化钠-柠檬酸钠溶液）与组分Ⅳ沉淀的混合比例为12:1～3:1（m/v）；抽提温度为4～36℃；抽提pH为5.5～11，抽提时间为1～2小时；然后在4～20℃温度下，用气动隔膜泵将抽提混合液进行压滤，去除不溶物；将压滤滤出液pH值调至7.2左右，采用10kD超滤膜进行超滤浓缩；

（2）、S/D病毒灭活

按步骤（1）最终所得液体体积的10%，加入11% S/D病毒灭活液，在24～25℃搅拌6小时，其中的11%S/D病毒灭活液，用含吐温-80和磷酸三丁酯（TNBP），按每110g吐温-80和33g TNBP加水至1千克的方法配制；

（3）亲和层析