[发明专利]一种捕食线虫真菌重组胞外丝氨酸蛋白酶的制备方法

摘要

本发明涉及一种捕食线虫真菌重组胞外丝氨酸蛋白酶的制备方法，属生物技术领域。主要包括以下步骤：根据胞外丝氨酸蛋白酶XAoz1基因序列，设计特异性引物并扩增目的片段；将扩增的目的片段PCR产物与载体pMD19-T连接构建重组载体pMD-XAoz1；用限制性内切酶SnaBⅠ和NotⅠ分别双酶切重组载体pMD-XAoz1与表达载体pPIC9K，回收的产物通过T4连接酶连接构建重组穿梭载体pPIC9K-XAoz1；将上述穿梭载体电转化进入表达宿主毕赤酵母菌PichiapastorisGS115感受态细胞等。其经济实用、表达高效，可为筛选自然高毒力的菌株或转基因构建遗传改良的抗性菌物奠定基础。

主权项

一种捕食线虫真菌重组胞外丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、根据已知的胞外丝氨酸蛋白酶XAoz1基因序列，用primer premier 5.0软件设计特异性引物并扩增目的片段，所涉及到的胞外丝氨酸蛋白酶的靶序列为：<210>1；所涉及的1对XAoz1‑f‑SnaBⅠ和XAoz1‑r‑NotⅠ引物扩增XAoz1基因片段，扩增长度为909 bp；引物序列为：XAoz1‑f‑SnaBⅠ：<210>2；XAoz1‑r‑NotⅠ：<210>3；（2）、将扩增得到的目的片段PCR产物与载体pMD19‑T连接构建重组载体pMD‑XAoz1；（3）、用限制性内切酶SnaBⅠ和NotⅠ分别双酶切重组载体pMD‑XAoz1与表达载体pPIC9K，两者纯化回收的产物通过T4连接酶连接构建重组穿梭载体pPIC9K‑XAoz1；（4）、将用SalⅠ线形化的穿梭载体pPIC9K‑XAoz1电转化进入表达宿主毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115感受态细胞；培养筛选单菌落，通过PCR鉴定正确后，获得GS115‑pPIC9K‑XAoz1重组菌；（5）、转化的上述毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115在甲醇诱导培养基中诱导发酵，表达重组蛋白酶；分别于不同培养时间获取培养上清，电泳前与上样缓冲液混合均匀，沸水浴5min～15min，然后进行SDS‑PAGE电泳并做Western blotting分析；（6）、诱导培养获得的重组胞外丝氨酸蛋白酶上清液经分离纯化后得到纯酶液。