[发明专利]一种捕食线虫真菌重组胞外丝氨酸蛋白酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种捕食线虫真菌重组胞外丝氨酸蛋白酶的制备方法，属生物技术领域。

背景技术

动物寄生线虫是一大类重要的动物病害，每年造成损失巨大，在线虫生物防治中，捕食线虫真菌是一类非常重要的线虫生防资源。

捕食线虫真菌是指以营养菌丝特化形成的粘性菌丝、粘性分枝、粘性球、粘性网、非收缩环、收缩环及冠囊体等捕食器官捕捉线虫的真菌。作为病原线虫的重要天敌，捕食线虫真菌是自然界中控制、平衡和调节线虫种群数量的重要生物因子。利用线虫天敌真菌进行动物病原线虫的防治是非常有潜力的生防途径，虽然活菌体的防效在实际应用时受到一些环境因素的限制，但仍可以利用它们产生的毒素或分泌的一些胞外酶来提高防治效果。捕食线虫真菌在侵染线虫过程中借助机械压力和分泌的胞外酶联合作用，促进了菌丝对线虫体壁的直接穿透，其中胞外酶起主导作用。蛋白酶能有效地降解线虫体壁，协助完成侵染过程，是侵染线虫的重要毒力因子。然而，捕食线虫真菌在自然条件下所产生和分泌的胞外酶的浓度是非常低的（1～2 μg），所以提高捕食线虫真菌胞外蛋白酶的表达水平是提高线虫生防制剂防效的一种途径。因此，为了能够在没有其他功能相关的蛋白酶干扰下检测分析侵染性蛋白酶对线虫体壁和内部组织的降解活力，为了能够对该蛋白酶进行更详细的生化性质研究，通过分子生物学手段构建能够高效稳定表达蛋白酶的低背景异源系统——毕赤酵母表达系统是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是通过对一株产生胞外丝氨酸蛋白酶并能够有效分解线虫体壁结构的捕食线虫真菌少孢节丛孢菌新疆分离株的研究，通过该种丝氨酸蛋白酶及其异源表达的方法，进一步提供一种经济实用、表达高效的该捕食线虫真菌重组胞外丝氨酸蛋白酶的制备方法。

本发明通过对一株产生胞外丝氨酸蛋白酶并能够有效分解线虫体壁结构的捕食线虫真菌少孢节丛孢菌新疆分离株的研究，报道一种丝氨酸蛋白酶及其异源表达的方法。 

本实验室在前期的研究中，从土壤中分离了一株捕食线虫真菌少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora XJ-XA），在LMZ培养液中能分泌降解线虫体壁的胞外丝氨酸蛋白酶。根据对GenBank所报道的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶的同源性分析，我们设计了一对特异性引物，通过RT-PCR扩增得到A. oligospora XJ-XA编码成熟蛋白酶的基因序列。

上述的从土壤中分离的一株捕食线虫真菌少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora XJ-XA），在申请日前在非专利文献中已公开，所述非专利文献出处包括：

[1] 孟庆玲, 王为升, 王俊伟, 才学鹏, 罗建勋, 陈创夫, 乔 军. 少孢节丛孢菌的分离鉴定及捕食线虫活性研究[J]. 中国预防兽医学报, 2011, 33(3): 189-193.

[2] 杨莲茹, 杨晓野, 杨玉琴, 刘珍莲, 郭媛华. 捕食线虫性真菌的分离鉴定[J]. 中国兽医寄生虫病, 1999, 7(1): 20-21.

[3] 杨晓野. 捕食线虫性真菌分离与生物学特性研究[D]. 北京：中国农业大学, 2002.

公众可以获得该捕食线虫真菌少孢节丛孢菌生物材料，申请人已提供了从申请日起二十年内向公众发放该生物材料的证明。

由于胞外丝氨酸蛋白酶是参与食线虫真菌侵染线虫的重要毒力因子。因此，可以通过分子生物学手段构建能够高效稳定表达蛋白酶的低背景异源系统—毕赤酵母表达系统，增加蛋白酶的表达水平，不仅可用来进行酶结构与功能关系的研究，还能用来进行天然和重组表达蛋白酶在穿透体壁和侵染线虫中的免疫定位实验，以提供进一步的实验证据支持蛋白酶参与的侵染机制，促进线虫生防菌株的基因工程菌研究开发；也为性质独特的真菌胞外蛋白酶能在其它领域的应用奠定前期的研究基础。

本发明主要涉及以下几个方面的内容：

1、捕食线虫真菌少孢节丛孢菌新疆分离株的成熟胞外丝氨酸蛋白酶（XAoz1）编码基因的克隆：本实验室分离纯化的少孢节丛孢菌胞外丝氨酸蛋白酶基因序列（已提交GenBank，登录号为JF747254）。

XAoz1基因扩增的靶序列为：<210>1。

2、特异性引物的设计及合成：根据XAoz1基因的靶序列，用primer premier 5.0软件进行引物设计。XAoz1-f-SnaBⅠ和XAoz1-r-NotⅠ引物扩增XAoz1基因片段，扩增长度为909 bp。引物序列为：