[发明专利]一种捕食线虫真菌重组胞外丝氨酸蛋白酶的制备方法有效
| 申请号： | 201310021164.8 | 申请日： | 2013-01-21 |
| 公开（公告）号： | CN103103172A | 公开（公告）日： | 2013-05-15 |
| 发明（设计）人： | 孟庆玲;乔军;王俊伟;王为升;张再超;蔡扩军;杨丽红;陈创夫;赵春光 | 申请（专利权）人： | 石河子大学 |
| 主分类号： | C12N9/58 | 分类号： | C12N9/58;C12N15/81;C12R1/645;C12R1/84 |
| 代理公司： | 石河子恒智专利代理事务所 65102 | 代理人： | 朱永慧 |
| 地址： | 832000 新*** | 国省代码： | 新疆;65 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 捕食 线虫 真菌 重组 丝氨酸 蛋白酶 制备 方法 | ||
1.一种捕食线虫真菌重组胞外丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）、根据已知的胞外丝氨酸蛋白酶XAoz1基因序列，用primer premier 5.0软件设计特异性引物并扩增目的片段，所涉及到的胞外丝氨酸蛋白酶的靶序列为：<210>1；所涉及的1对XAoz1-f-SnaBⅠ和XAoz1-r-NotⅠ引物扩增XAoz1基因片段，扩增长度为909 bp；引物序列为：
XAoz1-f-SnaBⅠ：<210>2；XAoz1-r-NotⅠ：<210>3；
（2）、将扩增得到的目的片段PCR产物与载体pMD19-T连接构建重组载体pMD-XAoz1；
（3）、用限制性内切酶SnaBⅠ和NotⅠ分别双酶切重组载体pMD-XAoz1与表达载体pPIC9K，两者纯化回收的产物通过T4连接酶连接构建重组穿梭载体pPIC9K-XAoz1；
（4）、将用SalⅠ线形化的穿梭载体pPIC9K-XAoz1电转化进入表达宿主毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115感受态细胞；培养筛选单菌落，通过PCR鉴定正确后，获得GS115-pPIC9K-XAoz1重组菌；
（5）、转化的上述毕赤酵母菌Pichia pastoris GS115在甲醇诱导培养基中诱导发酵，表达重组蛋白酶；分别于不同培养时间获取培养上清，电泳前与上样缓冲液混合均匀，沸水浴5min～15min，然后进行SDS-PAGE电泳并做Western blotting分析；
（6）、诱导培养获得的重组胞外丝氨酸蛋白酶上清液经分离纯化后得到纯酶液。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于石河子大学，未经石河子大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201310021164.8/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
