[发明专利]聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体的制备方法

摘要

本发明公开了一种聚阳离子脂质体包裹磷酸钙纳米粒的基因给药载体的制备方法，采用改进的共沉淀法或反相微乳制备磷酸钙纳米粒，提高磷酸钙纳米粒的稳定性，以两亲性化合物聚乙烯亚胺-胆固醇、磷脂和/或胆固醇作为脂质体膜材，采用脂质体与磷酸钙纳米粒共同孵育得到所述基因给药载体；本发明通过对磷酸钙纳米粒处方和制备工艺的改进，提高了磷酸钙纳米粒的稳定性，利用脂质体包裹技术进一步克服了磷酸钙纳米粒易聚集沉淀的倾向，脂质体表面的聚阳离子增加了细胞对载体的摄取及内体逃逸的能力；本发明所制备的基因给药复合载体在保留磷酸钙载体安全、经济的基础上，提高了细胞摄取和转染效率，具有广阔的应用前景。

主权项

聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体的制备方法，其特征在于所述方法为：（1）磷酸钙纳米粒溶液的制备：将表面活性剂A水溶液、基因水溶液和氯化钙水溶液混合制成混合液A1，然后将表面活性剂B水溶液、磷酸盐水溶液和柠檬酸钠水溶液混合制成混合液A2，最后在搅拌的条件下将混合液A2逐滴滴入混合液A1中，滴加完毕后，室温搅拌0.5~2h，获得混合液，即磷酸钙纳米粒溶液；所述氯化钙水溶液中钙离子与磷酸盐水溶液中磷酸根离子的物质的量之比为1：0.001～1，氯化钙水溶液中钙离子与基因水溶液中基因的质量比为1～100：1，所述氯化钙水溶液的浓度为5~500mmol/L，表面活性剂A和表面活性剂B的总质量用量为最终磷酸钙纳米粒溶液体积的0.01～2%，柠檬酸钠水溶液中柠檬酸钠的总质量用量为最终磷酸钙纳米粒溶液体积的0.001%～1%；所述表面活性剂A为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、十二烷基硫酸钠、聚山梨醇、聚乙二醇或聚乙二醇单硬脂酸酯中的一种或两种以上任意比例的混合，所述表面活性剂B和表面活性剂A为相同的表面活性剂；所述磷酸盐水溶液中磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二氨、二磷酸盐或三聚磷酸钠中的一种；所述基因包括质粒DNA、小分子干扰RNA和反义寡核苷酸；（2）聚阳离子脂质体溶液的制备：将聚乙烯亚胺‑胆固醇与磷脂和/或胆固醇用有机溶剂A溶解后，真空旋转蒸发至干去除有机溶剂A，获得脂质薄膜，在脂质薄膜中加入去离子水，水浴超声处理5～30min，然后再在冰浴、100～400W条件下利用超声波探头处理1～10min后，最后采用孔径0.1～0.8μm的滤膜处理，取滤液，获得聚阳离子脂质体溶液；所述聚乙烯亚胺‑胆固醇中的聚乙烯亚胺分子量为600～50000Da；所述有机溶剂A为氯仿、二氯甲烷、乙醚、石油醚或乙醇中的一种或两种以上任意比例的混合物；所述磷脂为天然磷脂或合成磷脂；所述聚乙烯亚胺‑胆固醇与磷脂的质量比为1：0.01～100，所述聚乙烯亚胺‑胆固醇与胆固醇的质量比为1：0～10；（3）聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体的制备：将步骤（1）制备的磷 酸钙纳米粒溶液与步骤（2）制备的聚阳离子脂质体溶液分别用去离子水稀释后等体积混合，在室温孵育5～60min后，获得所述聚阳离子脂质体/磷酸钙纳米粒给药载体；所述聚阳离子脂质体溶液的质量用量以聚乙烯亚胺‑胆固醇分子中氨基的物质的量计，所述磷酸钙纳米粒溶液的质量用量以原始加入的基因分子中磷酸根的物质的量计，所述氨基与所述的磷酸根投料物质的量之比为0.01～1000：1。