[发明专利]一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅱ的制备方法

摘要

本发明提供肝素黄杆菌肝素酶Ⅱ的制备方法，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养，再接到发酵培养基，离心收集沉淀，沉淀超声破碎，离心得到肝素黄杆菌肝素酶的粗酶液，然后将粗酶液通过硫酸铵沉淀分离去部分杂质，再通过一次SP-SepharoseFF层析分离出肝素酶Ⅱ，再通过肝素亲和柱层析、CellufineSulfate柱层析、SP-HPLC等步骤的精细纯化最终制备出高纯度肝素酶Ⅱ。

主权项

一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅱ的制备方法，所述方法包括下述步骤：（1）肝素酶粗酶液的制备： 将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃、150rpm培养1天，然后按5%接种量接入发酵培养基，23℃、150rpm培养2‑3天，菌液10000rpm、4℃离心15‑30分钟，收集沉淀，悬浮在25mM Tris‑HCl缓冲液中，冰浴超声（150W、5s、5s），4℃、10000rpm离心30min，上清即为粗酶液； （2）硫酸铵沉淀除杂质：冰浴中向粗酶加入等体积的溶于10‑25mM Tris‑HCl 缓冲液的饱和硫酸铵溶液，缓慢滴加，加完后冰浴中缓慢搅拌沉淀30min，然后18000rpm离心30min，取上清，冰浴中向其中再缓慢加入干燥的硫酸铵粉末（153g/L溶液）至饱和度70%，搅拌30min，然后18000rpm离心30min，弃上清，将沉淀以25mM Tris‑HCl缓冲液适量溶解，装入截留分子量10KD透析袋中对100倍体积上述缓冲液过夜透析，得去除杂质后的酶液；（3）肝素酶Ⅱ的SP柱分离：将步骤（1）所得粗酶液上一根用10‑25mM的Tris‑HCl平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度0‑0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的洗脱液，收集液各管随洗脱的进行呈两个分离完全的活性峰靠前的那个为肝素酶Ⅱ，靠后的那个为肝素酶Ⅰ和肝素酶Ⅲ的混合物；（4）肝素酶Ⅱ的肝素亲和层析纯化：步骤（3）肝素酶Ⅱ活性峰洗脱液透析后上一根用5‑10mM Tris‑HCl缓冲液平衡过的HEP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris‑HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑0.1M洗脱，收集测得有酶活性的洗脱液若干管，合并、透析；（5）肝素酶Ⅱ的CS（Cellufine Sulfate）柱纯化：步骤（4）得到的酶液上一根用10‑50mMTris‑HCl缓冲液平衡过的Cellufine Sulfate柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0‑1.5M洗脱，收集测得有酶活性的洗脱液若干管，合并、透析；（6）肝素酶Ⅱ的SP‑HPLC纯化：步骤（5）得到的酶液上一根用10mM Tris‑HCl缓冲液平衡过的SP‑HPLC柱，以同样缓冲液中氯化钠线形梯度0‑1.0M洗脱，收集测得有酶活性的洗脱液若干管，合并、透析，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶Ⅱ；其中，步骤（1）所述的种子培养基的组成为：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L ，酵母粉 5 g/L，NaCl为5 g/L，pH7.0；步骤（1）所述的发酵培养基组成为：肝素8g/L, K2HPO4 2.5 g/L, NaH2PO4 2.5 g/L, NH4Cl 2.0 g/L, MgCl2 0.5 g/L, 组氨酸 0.5 g/L, 甲硫氨酸 0.5 g/L, 微量元素（NaMoO3, CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2，各1×10‑4M）；步骤（1）、（2）、（3）、（5）、（6）所述Tris‑HCl缓冲液均含10mM CaCl2、pH6.5‑8.0, 优选pH范围为7.0‑7.5。