[发明专利]一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅱ的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肝素酶Ⅱ的制备方法，尤其涉及一种由氯化钙保护之下，含硫酸铵沉淀分离、SP-Sepharose FF柱层析、肝素亲和柱层析、Cellufine Sulfate柱层析、SP-HPLC等步骤的纯化制备肝素酶Ⅱ的方法。

背景技术

肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆菌的3种酶，分别是肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ。肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别是分子量大约43、78、66kd的单体蛋白质，其等电点均在9.0左右，应用和研究非常广泛。

肝素酶的纯化工作有许多研究报道，Yang等（J Biol Chem, 1985, 260 (3):1849-1857）用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过滤等四步纯化，制得纯肝素酶Ⅰ，活性收率大约1%。Daniel等（J Bio Chem, 1992,267(34): 24347-24355）用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-Sepharose柱层析、HA-HPLC、Mono-S FPLC、GPC-HPLC等五步纯化，最终获得纯的肝素酶Ⅰ，比活性达到130IU/mg，活性回收率为10.8%；用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-Sepharose柱层析、HA-HPLC、GPC-HPLC等四步纯化，最终获得纯的肝素酶Ⅱ，比活性达到19IU/mg，活性回收率为1.02%；用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-Sepharose柱层析、HA-HPLC、Mono-S FPLC、GPC-HPLC等五步纯化，最终获得纯的肝素酶Ⅲ，比活性达到63.5IU/mg，活性回收率为2.74%。

发明人（食品与药品，2005，32（5）：446-450）使用羟基磷灰石吸附/解吸、DEAE－Sepharose柱层析、CM－Cellose柱层析等三步纯化法，纯化得到肝素酶Ⅰ，活性收率13.4%；并（J Chrom B,2006,843(2):209-215）通过硫酸铵沉淀、octyl-sepharose 柱层析、CM-650柱层析、SP-650 柱层析、sephadex G-100柱层析等五步纯化法获得纯化的肝素酶Ⅰ，收率达到17.8%。在2009年5月提交的“一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ制备方法”（专利申请号200910039360.1）中，建立了一种全新的纯化制备工艺，获得高达30%的纯酶活性收率，制备的肝素酶Ⅰ比活高达223IU/mg。在2011年8月提交的“一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ制备方法”（专利申请号201110241260.4）中，给出一种同时制备纯化出肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的方法，制备的肝素酶Ⅰ、Ⅲ比活高达417和235IU/mg，肝素酶Ⅱ比活为15.3IU/mg。

本专利给出一种肝素酶Ⅱ的制备方法，通过多步柱层析，制备出高纯度肝素酶Ⅱ，比活进一步提高到27.2 IU/mg。方法高效、可重复，所得酶纯度极高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高纯度肝素酶Ⅱ的制备方法，该方法可纯化出高纯度肝素酶Ⅱ，其比活高于文献最高报道值。

本发明包括下述步骤：

（1）肝素酶粗酶液的制备：

将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃、150rpm培养1天。然后按5%接种量接入发酵培养基，23℃、150rpm培养2-3天。菌液10000rpm、4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在25mM Tris-HCl缓冲液中，冰浴超声（150W，超5s，停5s）。4℃、10000rpm离心30min，上清即为粗酶液；

（2）硫酸铵沉淀除杂质：

冰浴中向粗酶加入等体积的溶于10-25mM Tris-HCl 缓冲液的饱和硫酸铵溶液，缓慢滴加，加完后冰浴中缓慢搅拌沉淀30min，然后18000rpm离心30min。取上清，冰浴中向其中再缓慢加入干燥的硫酸铵粉末（153g/L溶液）至饱和度70%，搅拌沉淀30min，然后18000rpm离心30min。弃上清，将沉淀以25mM Tris-HCl缓冲液适量溶解，装入截留分子量10KD透析袋中对100倍体积上述缓冲液过夜透析，得去除杂质后的酶液；

（3）肝素酶Ⅱ的SP柱（使用SP-sepharose FF填料）分离：