[发明专利]一种重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种重组羧酸酯酶D-1CarE5的制备方法及其在农药马拉硫磷降解中的应用。用大肠杆菌羧酸酯酶D-1CarE5工程菌，经α-乳糖诱导表达16h，产生大量的可溶性重组羧酸酯酶D-1CarE5蛋白，使用Ni2+-NTA重力纯化柱对其进行纯化。以β-乙酸萘酯为底物对重组羧酸酯酶D-1CarE5性质进行酶活测定。应用方法为：在含有浓度为5.5mg/L农药马拉硫磷、pH7.0、1/15mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中添加1U（以β-乙酸萘酯为底物测酶活性）的羧酸酯酶D-1CarE5，总反应体系3ml，温度37℃条件下震荡反应，对终浓度为5.5mg/L农药马拉硫磷进行降解。降解结果显示，25min内就有50%的马拉硫磷被降解，100min内有89%的马拉硫磷被降解，证明重组羧酸酯酶D-1CarE5在农药残留或农药污染的治理方面具有较好的效果。

主权项

一种重组羧酸酯酶D‑1CarE5的制备方法，其特征在于按以下进行： 1）取大肠杆菌羧酸酯酶D‑1CarE5工程菌株以0.1%的接种量接种于LB培养液中，37 ℃快速振荡12 h，然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB诱导培养液中，其含50 µg/mL Kan和0.5% w/v α‑乳糖，振荡培养16 h，12000 rpm离心5 min，收集菌体；用适量的pH7.0 Tris‑HCl缓冲液悬浮菌体后，于冰水混合物下超声波破碎菌体，以上胞内浓缩的粗酶液经13,000 rpm离心10 min后，吸取上清液用Nickel‑NTA  Agarose来纯化目的蛋白；2）纯化：将2 mL的Nickel‑NTA  Agarose装到空柱子中，用以下缓冲液，pH均为7.0：NTA‑0：20mM Tris‑HCl，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA‑20：20mM Tris‑HCl，20mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA‑40：20mM Tris‑HCl，40mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA‑60：20mM Tris‑HCl，60mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA‑80：20mM Tris‑HCl，80mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA‑100：20mM Tris‑HCl，100mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA‑200：20mM Tris‑HCl，200mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA‑300：20mM Tris‑HCl，300mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；NTA‑500：20mM Tris‑HCl，500mM 咪唑，0.5M NaCl，10%（w/v）甘油；纯化步骤为：（a）20 mL的水平衡；（b）20 mL的NTA‑0平衡；（c）加样品2 mL；（d）收集穿透峰；（e）分别用2 mL的NTA‑20、NTA‑40、NTA‑60、NTA‑80、NTA‑100、NTA‑200、NTA‑300、NTA‑500依次洗脱，并分别收集洗脱液；（f）将洗脱液分别以β‑乙酸萘酯为底物进行酶活测定；（g）纯化后的酶液通过酶活测定和蛋白质电泳鉴定后，‑20℃保存备用；羧酸酯酶D‑1CarE5氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2，构建羧酸酯酶D‑1CarE5工程菌所用的载体为pET28a(+)，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。