[发明专利]一种用于检测乙型脑炎疫苗病毒抗原含量的方法

摘要

本发明涉及一种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，其要点是：首先在96孔酶标板上包被乙脑病毒多克隆抗体，包被完成后每孔分别加入乙脑阳性、阴性对照及经过梯度稀释后的待检样品，37℃孵育后清洗酶标板，加入乙脑病毒E蛋白单克隆抗体，37℃孵育后清洗酶标板，加入辣根酶标记结合物，37℃孵育后清洗酶标板，加底物显色液显色，终止后酶标仪读取OD值，计算P/N值，确定抗原含量。本发明可快速检测乙脑抗原含量，以及鉴别乙脑疫苗的真伪，并为乙脑疫苗的生产提供有利的数据支持。

主权项

一种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，其特征在于有以下步骤：(1)兔抗乙型脑炎多克隆抗体制备1)注射抗原制备震荡CFA(完全弗氏佐剂)或IFA(不完全弗氏佐剂)，4℃下与同体积的乙脑病毒纯化原液在玻璃试管内混合，直至乳状剂形成，挤出一滴至冷水表面上，如在水面上举成一滴，证明可以使用，如液滴分散，继续混匀，将配置成的乳状剂转移至2.5ml注射器，准备注射；2)免疫程序注射前兔子耳源取血作为实验血清空白对照：初次免疫注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量1ml/点，共注射5ml(使用CFA)注射病毒蛋白量0.8mg；加强免疫(间隔一周)注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.5ml/点，注射共2.5ml(使用IFA)注射病毒蛋白量0.4mg；加强免疫(间隔一周)注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.2ml/点，注射共1ml(使用IFA)注射病毒蛋白量0.2mg，间隔一周后，心脏采血制备抗血清；3)分离血清检测抗体将新鲜采集的血液，分装至15ml无菌离心管中，室温条件下斜面放置4小时，使血块形成，4℃下放置过夜使血块缩小；使用无菌枪头剥离血块，将血清转移至另一新离心管中，3000g离心10min，保留上清液，然后对血清中抗体进行检测；4)抗血清IgG纯化盐析法粗体‑硫酸铵沉淀4‑1在离心管中加入5ml血清和5ml 0.02mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液，混匀，用枪头吸取10ml SAS，边滴加边搅拌，使溶液饱和度达到50％，用滴管边加边搅拌，搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性，加完后在室温放置4℃过夜，以3000r/min离心10min，白蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白，弃去上清液，留下沉淀部分；4‑2将所得沉淀再溶于5ml 0.02mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液中，滴加2.7mlSAS，使溶液的饱和度达35％，加完后4℃放置20min，以3000r/min离心15min，α、β球蛋白在上清液中，沉淀为IgG，弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀；4‑3将获得的粗IgG沉淀溶解于5ml 0.02mol/L，pH 7.0磷酸缓冲液中；5)蛋白A亲和纯化5‑1柱平衡：用Binding buffer清洗柱，5‑10个体积；5‑2上样：使用注射器缓慢挤压1ml样品进入柱内；5‑3清洗：使用Binding buffer清洗柱，5‑10个柱体积；5‑4洗脱：使用Elution buffer洗脱柱，同时收集3个柱体积洗脱组分；5‑5合并洗脱组分，测定IgG的含量为5mg/ml和抗体活性；(2)ELISA方法的建立将兔抗乙脑病毒多克隆抗体不同稀释浓度(5μg/ml，10μg/ml)包被96孔板，200μl/孔，用封口膜封好，置于湿盒中37℃3小时，然后4℃过夜，取出倒空板，加300μl/孔封闭液，用封口膜封严后置于湿盒中37℃1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于‑70℃保存；样品以2倍法稀释256\512\1024三个稀释度，将预先包被好的酶标板从‑70℃冰箱中取出，用洗板机清洗4次，洗液300μl/孔，倒空板，加样200μl/孔，空白孔由稀释液代替，用封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；取出板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔，加乙脑病毒E蛋白单克隆抗体(稀释度分别10^‑410^‑5)200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；取出板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔，加辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物(稀释度分别10^‑410^‑5)200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育60min；取出板，洗板机清洗6次，洗液300μl/孔，加OPD显色液，200μl/孔，室温下避光反应30min；显色后H₂SO₄终止液，50μl/孔，使用酶标仪，并在492nm测定各孔OD值；(3)具体实验样品检测将兔抗乙脑病毒多克隆抗体(浓度5mg/ml)配制成包被液，每孔加包被液200μl，用封口膜封好，置于湿盒中37℃3小时，然后4℃过夜后取出倒空板，加300μl/孔封闭液，再用封口膜封好置于湿盒中37℃1小时，最后倒空板，用封口膜封好，置于‑70℃保存；样品以2倍法稀释(64、128、256、512)，将预先包被好的酶标板从‑70℃冰箱中取出，洗板机清洗4次，洗液300μl/孔，倒空板，加样200μl/孔，由低稀释度往高稀释度加，每次实验设空白对照、阳性对照、阴性对照各两孔，加样后酶标板用封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔，将稀释度为10^‑4的乙脑病毒E蛋白单克隆抗体加到酶标板上，200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育90min；取出酶标板，洗板机清洗5次，洗液300μl/孔，将稀释度10^‑5的辣根酶标记山羊抗小鼠过氧化物加到酶标板上，200μl/孔，封口膜密封，置于37℃湿盒中孵育60min；取出酶标板，洗板机清洗6次，洗液300μl/孔。加入OPD显色液，200μl/孔，室温下避光反应30min；显色后加50μl/孔终止液，设定相应的空白，酶标仪492nm测定；结果判定：当阴性对照OD值≤0.1，阳性对照OD值≥1.0时，该试验成立；若阴性对照平均OD值≤0.05，按0.05计算；若阴性对照平均OD值＞0.05，按实际OD值计算；当P/N≥2.1时，则判定样品在该稀释度下呈阳性，并确定呈阳性的最大稀释度；其中：P是样品平均OD值N是阴性对照平均OD值。