[发明专利]一种用于检测乙型脑炎疫苗病毒抗原含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物制剂的检测方法，特别是涉及一种利用双抗夹心ELISA原理快速检测乙脑病毒抗原含量、鉴别乙脑疫苗真伪的用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，属于生物技术领域。特别适合应用在乙型脑炎疫苗生产企业的质量控制环节。 

背景技术

流行性乙型脑炎是由乙脑病毒引起、由蚊虫传播的一种急性传染病。乙脑的病死率和致残率高，是威胁人群特别是儿童健康的主要传染病之一。我国是乙脑高流行区，在20世纪60年代和70年代初期全国曾发生大流行，70年代以后随着大范围接种乙脑疫苗，乙脑发病率明显下降，近年来维持在较低的发病水平。由此可见乙脑疫苗在预防乙脑流行上起着重要作用。而乙脑病毒抗原作为乙脑疫苗的最主要成分，其含量对疫苗质量起到至关重要的作用。 

在现有技术中，国内并没有公开乙脑病毒抗原含量检测的方法，也查不到国外企业的相关报道。根据生产企业实际的生产情况，迫切需要能有一种检测乙脑病毒抗原含量的方法，以便有效的预知成品疫苗的抗原含量，为疫苗成品生产提供可靠的定量数值依据，并用于快速鉴别疫苗真伪。 

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的上述不足，公开一种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法。本发明应用ELISA双抗体夹心原理，首先在96孔酶标板上包被乙脑病毒多克隆抗体，包被完成后每孔分别加入乙脑阳性、阴性对照及经过梯度稀释后的待检样品，37℃孵育后清洗酶标板，加入乙脑病毒E蛋白单克隆抗体，37℃孵育后清洗酶标板，加入辣根酶标记结合物，37℃孵育后清洗 酶标板，加底物显色液显色，终止后酶标仪读取OD值。计算P/N值，确定抗原含量。本发明可快速检测乙脑抗原含量，以及鉴别乙脑疫苗的真伪。并为乙脑疫苗的生产提供有利的数据支持。 

本发明给出的技术方案是：这种用于检测乙型脑炎病毒抗原含量的方法，其特征在于有以下步骤： 

(1)兔抗乙型脑炎多克隆抗体制备 

1)注射抗原制备(乳化)震荡CFA(完全弗氏佐剂)或IFA(不完全弗氏佐剂)，4℃下与同体积的乙脑病毒纯化原液在玻璃试管内混合，直至乳状剂形成，挤出一滴至冷水表面上，如在水面上举成一滴，证明可以使用，如液滴分散，继续混匀，将配置成的乳状剂转移至2.5ml注射器，准备注射； 

2)免疫程序 

注射前兔子耳源取血作为实验血清空白对照： 

初次免疫 

注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量1ml/点，共注射5ml(使用CFA)注射病毒蛋白量约0.8mg； 

加强免疫(间隔一周) 

注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.5ml/点，注射共2.5ml(使用IFA)注射病毒蛋白量约0.4mg。 

加强免疫(间隔一周) 

注射部位为两肩后侧及两髋附近，为皮下、肌肉注射5点，注射剂量0.2ml/点，注射共1ml(使用IFA)注射病毒蛋白量约0.2mg， 

间隔一周后，心脏采血制备抗血清； 

3)分离血清检测抗体 

将新鲜采集的血液，分装至15ml无菌离心管中，室温条件下斜面放置4小时，使血块形成，4℃下放置过夜使血块缩小；使用无菌枪头剥离血块，将血清转移至另一新离心管中，3000g离心10min，保留上清液，然后对血清中抗体进行检测； 

4)抗血清IgG纯化 

盐析法粗体—硫酸铵沉淀 

4-1在离心管中加入5ml血清和5ml 0.02mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液，混匀，用枪头吸取10ml SAS，边滴加边搅拌，使溶液饱和度达到50％，用滴管边加边搅拌，搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性，加完后在室温放置4℃过夜，以3000r/min离心10min，白蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白，弃去上清液，留下沉淀部分； 

4-2将所得沉淀再溶于5ml 0.02mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液中，滴加2.7mlSAS，使溶液的饱和度达35％，加完后4℃放置20min，以3000r/min离心15min，α、β球蛋白在上清液中，沉淀为IgG，弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀； 

4-3将获得的粗IgG沉淀溶解于5ml 0.02mol/L，pH 7.0磷酸缓冲液中； 

5)蛋白A亲和纯化 

5-1柱平衡：用Binding buffer清洗柱，5-10个体积； 

5-2上样：使用注射器缓慢挤压1ml样品进入柱内；