[发明专利]一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法

摘要

本发明公开了一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法。该方法以红姜花未成熟的花丝和花药为外植体进行愈伤组织的诱导，经过优化、筛选、继代培养获得高质量的胚性愈伤组织，将胚性愈伤组织进行悬浮培养，建立红姜花的胚性细胞悬浮培养系。利用胚性细胞悬浮培养物进行体胚诱导可获得大量体胚，采用SH无机盐、150μg·L-1TDZ时可获得最佳效果，其体胚发生频率可达到4429个/mL SCV；所获得的体胚在体胚萌发培养基上可萌发出带有芽、根的幼苗，当以SH为基本培养基、6-BA为0.5～1.0mg·L-1时，体胚的萌发频率可达100%。本发明为红姜花的离体快速繁殖和生物技术育种奠定基础，有利于大规模的推广应用，具有较好的应用前景。

主权项

一种通过红姜花体细胞胚胎发生途径高效再生植株的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）愈伤组织的诱导和胚性愈伤组织的优化增殖：以红姜花未成熟的花丝和/或花药为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导培养出愈伤组织；将诱导出的愈伤组织继代培养在愈伤组织优化与增殖培养基上，得到黄白色粉状的胚性愈伤组织；（2）均一稳定的胚性细胞悬浮培养系的建立：将步骤（1）的黄白色粉状的胚性愈伤组织0.5～2.0g转入液体培养基中，置于90～110rpm摇床上悬浮培养1～2个月，得到分散、均质的胚性细胞悬浮培养系；（3）体细胞胚胎的诱导：取步骤（2）得到的胚性细胞悬浮培养系，调整细胞密度为10%SCV悬浮培养物，取0.5～2.0mL 10%SCV悬浮培养物接种于体胚诱导培养基中，置于28±1℃黑暗中进行体细胞胚胎诱导，得到成熟体细胞胚胎；（4）体细胞胚胎的萌发及其植株再生：将步骤（3）诱导出的成熟体细胞胚胎转入体胚萌发培养基中，置于28±1℃黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至生根壮苗培养基中继续培养，进一步发育成健壮的红姜花再生小植株；所述的愈伤组织诱导培养基的组成为：MS培养基+（2～4）mg·L‑12,4‑D+（2～4）mg·L‑1NAA+1mg·L‑16‑BA+30g·L‑1蔗糖+7g·L‑1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；所述的愈伤组织优化与增殖培养基的组成为：MS培养基+（1～2）mg·L‑12,4‑D+（0.25～1）mg·L‑1NAA+（0.25～1）mg·L‑16‑BA+30g·L‑1蔗糖+7g·L‑1琼脂粉，pH 5.8，高温高压灭菌；所述的液体培养基的组成为：MS培养基的无机盐+100mg·L‑1麦芽水解物+100mg·L‑1谷氨酰胺+230mg·L‑1脯氨酸+（0.02～0.25）mg·L‑1NAA+（0.5～1）mg·L‑12,4‑D+B5培养基的维生素+45g·L‑1蔗糖，pH 5.3，高温高压灭菌。