[发明专利]一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用

摘要

本发明涉及一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用，利用本发明提供的方法选用的荧光素标记BAC(细菌人工染色体)探针，运用连续荧光原位杂交法即探针洗脱重杂交，每次杂交后在荧光显微镜下对DAPI，Spectrum GreenTM，Cy3TM v1，Texas Red，Cy5，PF-415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，采用计算机自动荧光视野重定位法使每张切片所采集图像精确定位于同一视野，因此可以对单个正常或肿瘤细胞同时进行5-20个基因的分析。本发明提供了一种在单细胞水平筛选和验证多种基因异变的方法，可以用于多种疾病不同亚型的区分也可用于同一个亚型疾病的进一步分类。

主权项

一种定量多基因荧光原位杂交方法，其特征在于：包括如下步骤：1)、探针制作：在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Bioinformatics上定位检索含检测目的基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP连接到酶切好的DNA上，沉淀DNA，用含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针；2)杂交：将要检测的标本处理好后，加入步骤1)制作好的探针，加上盖玻片，用封片胶封片，放入杂交仪，变性后杂交过夜；3)洗片，荧光显微镜检：标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(Saline Sodium Phosphate EDTA，SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果；4)图像采集与分析：采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型，六种滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP‑100)，Spectrum GreenTM(MF101)，Cy3TM v1(SP‑102)，Texas Red(SP‑107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF‑415(45)组合，首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge‑Coupled Device，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z‑Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25‑30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像；5)检测基因个数n为1≤n≤5时，采用上述步骤1)‑4)即可完成检测分析，当检测基因个数n为5＜n≤10，需对第一次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当10＜n≤15，需对第二次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，当15＜n≤20，需对第三次杂交后标本进行原探针洗脱和新探针重杂交，每次杂交试验设计的检测基因个数最多为5个，当检测基因个数n为5＜n≤10，原探针洗脱和新探针重杂交步骤如下：第一次杂交实验图像采集后，切片存放于冷室以备下次重杂交使用，重杂交的新探针准备同步骤1)，制得新探针，备用；切片移去盖玻片，置于2×SSC中洗涤，每张切片滴加150μl的70％甲酰胺，70℃变性3分钟，迅速置于‑20℃预冷的70％乙醇，洗去陈旧的探针，梯度乙醇 中脱水，每张切片滴加10μl新探针，杂交、洗片同步骤2)、3)标本重杂交后图像采集：切片置于多色荧光显微镜下观察，采用计算机自动荧光视野重定位法(AxioVision Rel.4.8.2软件)使显微镜自动进入第一次图像采集位置，然后同时对DAPI，Spectrum GreenTM，Cy3TM v1，Texas Red，Cy5，PF‑415六个滤光片通路中的荧光信息进行采集，因此，对于每张切片所有探针杂交完毕后所采集图像均在同一视野，可同时对同一细胞进行多基因分析。