[发明专利]一种角质酶的分离纯化方法

摘要

本发明提供一种镰刀菌属Fusarium、炭疽菌属Colletotrichum、链核盘菌属Monilinia、曲霉属Aspergillus、黑星菌属Venturia、链格孢菌属Alternaria、葡萄孢菌属Botrytis、壳二孢属Ascochyt来源的角质酶发酵液的分离纯化方法，其特点在于选用硫酸铵沉淀和疏水色谱进行分离纯化后，可根据角质酶纯度选用弱阴离子交换进行进一步的分离纯化，得到了电泳纯的角质酶溶液，可根据后续需求进行进一步的加工。本发明适用范围广，方法简单，酶纯度高，是一种高效、简洁的酶分离纯化方法。

主权项

一种角质酶的分离纯化方法，其特征在于：(1)将角质酶发酵液离心去除菌体后，向粗酶液中缓慢加入经研磨烘干后固体硫酸铵，使硫酸铵达到一定浓度，冷冻离心，收集沉淀，将沉淀用适量Tris‑HCl缓冲液溶解后，倒入经煮沸处理后的透析袋中，相同缓冲溶液中透析，透析后离心，收集上清液。(2)向步骤(1)透析后的酶液加入经研磨烘干后的固体硫酸铵至一定饱和度，上样于经30％硫酸铵饱和的Tris‑HCl缓冲液预平衡的Phenyl‑Sepharose疏水柱，上样结束后先用30％硫酸铵饱和度的Tris‑HCl缓冲液平衡至A280值不变后，再用30％硫酸铵饱和的Tris‑HCl缓冲液与不含硫酸铵的Tris‑HCl缓冲液线性洗脱150min，最后用Tris‑HCl缓冲液洗脱，流速为2.5mL/min，测定280nm吸收峰处集中管中酶液的活性，对活性较高的收集液进行SDS‑PAGE，确认蛋白纯度，若SDS‑PAGE结果显示多条蛋白带，则收集酶活性较高的酶液，进行DEAE‑Sepharose弱阴离子交换柱层析。(3)将步骤(2)酶活较高的收集液浓缩后在Tris‑HCl缓冲液中充分透析，加入同种缓冲液平衡的DEAE‑Sepharose层析柱中，酶蛋白经缓冲液洗脱至A280不变后，用Tris‑HCl缓冲液和含有NaCl的同一洗脱液线性梯度洗脱，流速为2.5mL/min，收集活性峰，即为所制备的电泳纯角质酶溶液。