[发明专利]一种角质酶的分离纯化方法

权利要求书

1.一种角质酶的分离纯化方法，其特征在于：

(1)将角质酶发酵液离心去除菌体后，向粗酶液中缓慢加入经研磨烘干后固体硫酸铵，使硫酸铵达到一定浓度，冷冻离心，收集沉淀，将沉淀用适量Tris-HCl缓冲液溶解后，倒入经煮沸处理后的透析袋中，相同缓冲溶液中透析，透析后离心，收集上清液。

(2)向步骤(1)透析后的酶液加入经研磨烘干后的固体硫酸铵至一定饱和度，上样于经30％硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液预平衡的Phenyl-Sepharose疏水柱，上样结束后先用30％硫酸铵饱和度的Tris-HCl缓冲液平衡至A280值不变后，再用30％硫酸铵饱和的Tris-HCl缓冲液与不含硫酸铵的Tris-HCl缓冲液线性洗脱150min，最后用Tris-HCl缓冲液洗脱，流速为2.5mL/min，测定280nm吸收峰处集中管中酶液的活性，对活性较高的收集液进行SDS-PAGE，确认蛋白纯度，若SDS-PAGE结果显示多条蛋白带，则收集酶活性较高的酶液，进行DEAE-Sepharose弱阴离子交换柱层析。

(3)将步骤(2)酶活较高的收集液浓缩后在Tris-HCl缓冲液中充分透析，加入同种缓冲液平衡的DEAE-Sepharose层析柱中，酶蛋白经缓冲液洗脱至A280不变后，用Tris-HCl缓冲液和含有NaCl的同一洗脱液线性梯度洗脱，流速为2.5mL/min，收集活性峰，即为所制备的电泳纯角质酶溶液。

2.根据权利要求1所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于：角质酶发酵液的来源可以为镰刀菌属Fusarium、炭疽菌属Colletotrichum、链核盘菌属Monilinia、曲霉属Aspergillus、黑星菌属Venturia、链格孢菌属Alternaria、葡萄孢菌属Botrytis、壳二孢属Ascochyt的真菌发酵。

3.根据权利要求1所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于：3个步骤所实施的温度均要求在0-4℃。

4.根据权利要求1所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于：3个步骤中所述的Tris-HCl缓冲液的pH值范围为7.0-9.0，其中步骤(1)中Tris-HCl缓冲液的浓度为20-40mM，步骤(2)和(3)中Tris-HCl缓冲液的浓度为8-20mM。

5.根据权利要求l所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中硫酸铵的浓度为90％-95％；透析时间为2-10小时。

6.根据权利要求1所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于：步骤(2)中向透析后的酶液加入经研磨后烘干的固体硫酸铵至一定饱和度指的饱和度为20％-60％。

7.根据权利要求1所述的角质酶分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)中NaCl的浓度为0.2-1.0mol/L。