[发明专利]miR-202实时荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种miR-202实时荧光定量PCR检测方法，包括）外周血中单个核细胞的分离、细胞中总RNA的提取、逆转录合成cDNA反应体系、荧光定量PCR扩增检测。本发明操作方便、检测准确；所采用的实时荧光定量PCR检测方法，巧妙地运用PCR技术的DNA高效扩增，高效、灵敏地检测miR-202。

主权项

一种miR‑202实时荧光定量PCR检测方法，其特征是：包括下列步骤：（1）外周血中单个核细胞的分离：取新鲜血液3ml，用EDTA抗凝；取淋巴细胞分离液，加入到15ml锥形离心管中，淋巴细胞分离液与血液的重量比为1:2；再将血液沿管壁铺到淋巴细胞分离液上面，2000r/min下离心20min，取血浆层与分层液交界处浑浊的富含单个核细胞的灰白层，用生理盐水洗涤2次，1500r/min离心10min，最后弃去上清，得分离的外周血中单个核细胞，‑80℃冰箱保存；（2）细胞中总RNA的提取取分离的外周血中单个核细胞5×106个，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min；加入0.2ml氯仿，振荡15sec，室温静置2min；4℃离心，12000r/min 15min，吸取上清至另一个1.5ml离心管中；加入0.5ml异丙醇，混匀，室温静置10min；4℃离心，12000r/min 10min，吸弃上清；加入1ml 75％乙醇，洗涤沉淀，4℃离心，7500r/min 5min，吸弃上清；晾干，加入20μl0.1％焦碳酸二乙酯H2O溶解，采用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度及纯度，取A260/A280在1.8～2.1用于实验；（3）逆转录合成cDNA反应体系：用RNA template 2μg，RT Primer 2μl，ddH2O补足至11μl，混匀离心，70℃放置10min，冰育2min，再加入以下试剂：RT buffer5× 5μl，dNTP mix 2μl，40U/μl的RNase inhibitor0.5μl，200U/μl的RT酶0.5μl，ddH2O补足至25μl，混匀，42℃ 60min，70℃ 10min；合成得到的cDNA放‑80℃冰箱保存备用；（4）荧光定量PCR扩增检测：反应体系：MaximaTM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2×）22.5μl，正反向5μM的Bulge‑LoopTM miRNA Primer各5μl，RT‑PCR产物2μl，RNase‑free H2O补足至50μl；95℃预变性20sec，1个循环；95℃ 10sec，60℃ 20sec，70℃ 31sec，40个循环；每管设立三个复孔；整个荧光定量PCR扩增反应过程冰上操作。