[发明专利]一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法和应用有效
| 申请号： | 201210214218.8 | 申请日： | 2012-06-27 |
| 公开（公告）号： | CN102766644A | 公开（公告）日： | 2012-11-07 |
| 发明（设计）人： | 魏涛;封盛雪;佘轩 | 申请（专利权）人： | 郑州轻工业学院 |
| 主分类号： | C12N15/56 | 分类号： | C12N15/56;C12N15/70;C12N9/44;C12P19/14 |
| 代理公司： | 郑州中原专利事务所有限公司 41109 | 代理人： | 张绍琳 |
| 地址： | 450002*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，它的步骤如下：（1）设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物；（2）PCR扩增及重组质粒的构建；（3）基因的诱导表达与蛋白质的纯化。本发明该酶活性最适酶活性为90℃，具有较为宽的酶适应温度，在50-100℃之间具有很高的酶活性；该酶的最适酶活pH为5.4，具有较好的耐酸性，在高温70℃和酸性条件pH为5.0处理36小时，仍保持50%以上的活性。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 酸性 普鲁兰酶 制备 方法 应用 | ||
【主权项】：
一种嗜热酸性普鲁兰酶的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：（1）设计并合成嗜热酸性普鲁兰酶的引物，引物的序列如下：上游引物 P1：5′‑ GGTTATCTCATATGTTCCCTGTACATCACC‑3′；下游引物 P2：5′‑ GAGCTGCCGTCGACAAGAAATCTTTATTTTTCATC‑3′；（2）PCR扩增及重组质粒的构建： 以嗜热细菌全基因组序列为模板进行扩增，PCR扩增条件如下：94℃ 预变性5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证；（3）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：将重组质粒转化E. coli BL21‑codonPlus(DE3)‑RIL，加入0.5‑1 mol/L IPTG于37℃继续培养3‑5 h，诱导表达的蛋白经过热处理，镍柱亲和层析，得到纯化的酶蛋白。
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