[发明专利]一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法

摘要

一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。本发明涉及利用枯草芽孢杆菌工程菌的发酵生产，发酵液经絮凝、过滤除菌、超滤浓缩、冷冻干燥等提取操作，获得亮氨酸氨肽酶的酶粉，并对所制备的酶考察其基本酶学特性。本发明对在野生枯草芽孢杆菌zj016基础上构建的高产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌PMA5-SAP，进一步进行发酵过程优化，采用培养基的预处理、培养基组成的调整、溶氧水平的控制等策略，使7L发酵罐产亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，发酵产酶又从7000U/L酶活单位提高到200000U/L左右。

主权项

一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于：将该枯草芽孢杆菌工程菌接入种子培养基中，待长到对数生长期后，以2%的接种量接入发酵培养基中，发酵培养30h，收集发酵液，通过絮凝、过滤除菌、超滤浓缩和冷冻干燥操作，获得亮氨酸氨肽酶酶粉，工艺为：A 枯草芽孢杆菌工程菌的发酵（1）出发菌株：采用枯草芽孢杆菌工程菌：以重组质粒PMA5‑SAP为出发菌株；重组质粒PMA5‑SAP详见中国专利CN102492645A；（2）种子培养基以g/L计：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，以去离子水配制，控制pH 7.4；（3）发酵培养基以g/L计：可溶性淀粉6，豆粕18，酵母膏24，胰蛋白胨8，甘油0.2% V/V，K2HPO4•3H2O 6，CoCl2 0.5mmol/L，硫酸卡那霉素 50µg/mL，以去离子水配制，控制pH8.0；（4）发酵条件：摇瓶条件：接种量2%，装液量50mL/250mL，搅拌转速200r/min，温度37℃，培养时间34h；发酵罐发酵条件：7L发酵罐，罐中装液量为4.5L，发酵温度37℃，接种量为2%V/V，搅拌转速300~600rpm，通气比为1.2∶1，罐压控制在0.06~0.08Mpa，溶氧与搅拌转速偶联，维持最低溶氧在30%，培养时间控制在30h；通过对原料预处理条件优化，控制溶氧水平，不时加消泡剂控制起泡策略，使发酵产酶水平得到进一步提高；其中原料豆粕的预处理：豆粕的适当水解：将豆粕与一定的水混匀，调节pH至7.5，中性蛋白酶用量为：中性蛋白酶300U/g豆粕，在40℃下，不停地搅拌，酶解1h；B 亮氨酸氨肽酶的提取：（1）发酵液的收集、絮凝过滤除菌：向发酵结束的发酵液中加入0.15%V/V的阳离子絮凝剂，进行絮凝，之后再以3g/L的量加入助滤剂硅藻土，混匀，过滤除去絮凝物及菌体，获得澄清发酵液；（2）将得到的澄清发酵液进行超滤浓缩，浓缩倍数在4~10倍，获得较纯的浓缩液，所选用的超滤膜截留分子量为30kDa；（3）将浓缩液冷冻干燥，获得亮氨酸氨肽酶酶粉。