[发明专利]一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法，其特征在于：将该枯草芽孢杆菌工程菌接入种子培养基中，待长到对数生长期后，以2%的接种量接入发酵培养基中，发酵培养30h，收集发酵液，通过絮凝、过滤除菌、超滤浓缩和冷冻干燥操作，获得亮氨酸氨肽酶酶粉，工艺为：

A 枯草芽孢杆菌工程菌的发酵

（1）出发菌株：采用枯草芽孢杆菌工程菌：以重组质粒PMA5-SAP为出发菌株；

重组质粒PMA5-SAP详见中国专利CN102492645A；

（2）种子培养基以g/L计：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，以去离子水配制，控制pH 7.4；

（3）发酵培养基以g/L计：可溶性淀粉6，豆粕18，酵母膏24，胰蛋白胨8，甘油0.2% V/V，K₂HPO₄·3H₂O 6，CoCl₂ 0.5mmol/L，硫酸卡那霉素 50μg/mL，以去离子水配制，控制pH8.0；

（4）发酵条件：

摇瓶条件：接种量2%，装液量50mL/250mL，搅拌转速200r/min，温度37℃，培养时间34h；

发酵罐发酵条件：7L发酵罐，罐中装液量为4.5L，发酵温度37℃，接种量为2%V/V，搅拌转速300~600rpm，通气比为1.2∶1，罐压控制在0.06~0.08Mpa，溶氧与搅拌转速偶联，维持最低溶氧在30%，培养时间控制在30h；通过对原料预处理条件优化，控制溶氧水平，不时加消泡剂控制起泡策略，使发酵产酶水平得到进一步提高；

其中原料豆粕的预处理：

豆粕的适当水解：将豆粕与一定的水混匀，调节pH至7.5，中性蛋白酶用量为：中性蛋白酶300U/g豆粕，在40℃下，不停地搅拌，酶解1h；

B 亮氨酸氨肽酶的提取：

（1）发酵液的收集、絮凝过滤除菌：向发酵结束的发酵液中加入0.15%V/V的阳离子絮凝剂，进行絮凝，之后再以3g/L的量加入助滤剂硅藻土，混匀，过滤除去絮凝物及菌体，获得澄清发酵液；

（2）将得到的澄清发酵液进行超滤浓缩，浓缩倍数在4~10倍，获得较纯的浓缩液，所选用的超滤膜截留分子量为30kDa；

（3）将浓缩液冷冻干燥，获得亮氨酸氨肽酶酶粉。