[发明专利]一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法

说明书

技术领域

一种枯草芽孢杆菌工程菌发酵制备亮氨酸氨肽酶的方法，具体地说是利用枯草芽孢杆菌工程菌发酵，收集发酵液，通过絮凝、过滤、超滤浓缩、冷冻干燥等提取操作，获得亮氨酸氨肽酶制品，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。

背景技术

蛋白酶的商品生产始于20世纪初，30年代微生物蛋白酶开始应用于食品和制革工业，近年来，微生物产酶的研究蓬勃发展。20世纪50年代初，日本学者首先发现霉菌中存在几种类型的蛋白酶，特别是酸性蛋白酶，20世纪60年代初，荷兰开始生产添加碱性蛋白酶的洗涤剂。到目前为止，国际市场上商品蛋白酶达100种以上。

蛋白酶制剂在蛋白加工领域中主要被用于改良风味、改善营养价值、生产抽提物、以及改变物理性质等。广义上，蛋白酶制剂包括两种类型：一类是蛋白酶，它能分解蛋白生成多肽或寡肽；另一类是肽酶，它能从末端开始切割蛋白和肽链并释放出游离单个氨基酸。酶作为生物催化剂具有反应条件温和、催化效率高和专一性强等优点，并因其高效、节能、经济、绿色、环保等的特点，其应用范围已遍及工业生产、农业、医疗诊断、环境保护、食品加工等领域。由于食品工业生产规模的日益扩大，食品行业的快速发展，食品添加剂特别是天然鲜味剂的需求也得到了快速增长。营养性天然鲜味剂是一类含氨基酸、肽类、核苷酸和糖分等物质并具有鱼肉和蔬菜等风味的调味料，主要包括动植物提取浸膏、蛋白质水解浓缩物和酵母浸膏等。

酶制剂是发酵产业的核心产品，酶制剂行业推动了发酵工业和相关行业的发展，并产生了巨大的经济和社会效益。目前，我国酶制剂行业发展较快，基本上满足了大宗产品生产的需求。但是在产品方面，要进一步提升新酶种的结构比例，特别是国外完全垄断的小酶品种。同时，加快开发和生产复合酶制剂，包括食品、纺织、饲料、纸浆、制革、造纸等专用复合酶制剂。此外，继续提高现有酶制剂酶的活性，提高产品档次。国内在氨肽酶生产方面的研究处于快速发展研究的阶段，实现产业化，填补国内产品的空白，替代进口产品，增强我国酶制剂行业竞争力，打破该产品被国外的垄断有着重要的意义。

目前蛋白质的水解方式逐渐从化学法向酶解法转变。用传统的方式水解蛋白质制备活性多肽，已经不能满足现代人民生活要求，在科技日新月异的今天，酶解蛋白质生产多肽已成为当今热门研究，通过不同的酶切方式可以获得不同功能的活性多肽，关于这方面已有很多相关的报道。大豆蛋白水解生产大豆多肽是大豆深加工的一个重要方向，因为大豆多肽不仅具有良好的营养特性，还具有广泛的生理药理作用和比大豆蛋白更丰富的功能特性，所以大豆多肽是一种很有前景的功能性食品原料。随着生物技术的进步和生命科学的发展，生理活性肽的生理功能逐步被人们发现，并受到越来越多的重视，尤其是一些活性肽的结构和生理功能逐渐明确，推动了活性肽的研究，也促进了大豆肽的研究与开发。

大豆多肽产品带有不同程度的苦味会直接影响食品的风味，给人们食用时会有一些“不愉快”，也在一定程度上限制了它在食品工业中的推广应用。研究证实当疏水性氨基酸残基处于多肽链的外侧时多肽呈现苦味，而单个的疏水性氨基酸苦味却低的多，因此采用外切酶将疏水性氨基酸从多肽链末端切去可以有效地减少苦味。另外该氨肽酶与其他蛋白酶复合使用，可以大幅度提高蛋白质的水解度，在酱油酿造、干酪生产中，可以提高蛋白质的利用率，节约成本。在医学研究中，该氨肽酶可用作医学上的解毒剂，也可用作环境消毒剂，亮氨酸氨肽酶还可用作蛋白质序列测定的分子工具。

一株野生枯草芽孢杆菌zj016经过传统诱变育种和发酵过程优化，发酵产酶的酶活单位可达7000U/L。本发明对在野生枯草芽孢杆菌zj016基础上成功构建的高产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌，进一步进行发酵过程优化，采用培养基的预处理、培养基组成的调整、溶氧水平的控制等策略，使7L发酵罐产亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，达到200000U/L左右。

发明内容

本发明是利用一株高产亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢杆菌工程菌，通过发酵培养、絮凝、过滤除菌、超滤浓缩、冷冻干燥等操作，获得固体亮氨酸氨肽酶，整个流程的收率为72.8%，酶粉酶活为7500 U/g，所得的固体酶的基本特性：最适温度50℃，温度稳定范围30～60℃，最适pH8.5，pH稳定范围6.0～9.5，存在一定的底物特异性，已发现其对多肽N端一种疏水的亮氨酸，一种碱性的精氨酸有较强水解作用。