[发明专利]加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法

摘要

本发明涉及加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法。该方法包括以下操作步骤：1.采集加拿大一枝黄花的茎和叶，2.茎和叶的固体培养与无菌检测，3.加拿大一枝黄花组织内生真菌的分离培养，得到加拿大一枝黄花内生真菌；所述菌落质地丝绒状，菌落表面绒状，浅橄榄色，无色素产生，背面带黑褐色；加拿大一枝黄花内生真菌菌株ITS基因组由602个碱基（bp）组成。本发明明确了具有广谱抗菌活性的球毛壳菌yt03（Chaetomiumglobosumyt03）菌株的微生物学地位，通过对球毛壳菌yt03抗菌发酵液的抗菌试验发现该菌对供试六种植物病原真菌具有较为明显的抑制菌丝生长作用。

主权项

加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法，其特征在于：所述加拿大一枝黄花内生真菌命名为球毛壳yt03（Chaetomium globosum yt03），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5088；具体的分离纯化操作步骤如下：（1）.采集加拿大一枝黄花的茎和叶；（2）.所述茎和叶的表面消毒与无菌检测：将步骤（1）采集的茎依次在浓度70%的酒精中浸泡50s、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡90s；将采集的叶片依次在浓度70%的酒精中浸泡40s、在浓度0.2%的次氯酸钠溶液中浸泡60s；将浸泡过的茎和叶用无菌水冲洗3次，阴干，得到消毒后的茎和叶；将消毒后的茎和叶分别切成 0.5 cm×0.5 cm大小的茎块和叶块；接着将一部分茎块和叶块直接种植于第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～7天；将另一部分茎块和叶块进行无菌检测：采用组织印迹法，将茎块和叶块置于第二块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上轻轻滚动或紧贴培养基放置2 min，接着移去茎块和叶块，在温度28℃恒温培养，培养7天，无杂菌长出即说明消毒后的茎块表面和叶块表面无菌；（3）.加拿大一枝黄花组织内生真菌的分离培养：当步骤（2）的第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板上加拿大一枝黄花的茎块和叶块周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，接种于第三块马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，温度24～28℃恒温培养，培养3～10天，长出完整菌落，即为加拿大一枝黄花内生真菌；加拿大一枝黄花内生真菌的菌落质地丝绒状，菌落表面绒状，浅橄榄色，无色素产生，背面带黑褐色；所述第一块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方、第二块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方和第三块马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基配方均为：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水1升；使用前马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基在温度121℃、压力0.1MPa下灭菌30 min；所述加拿大一枝黄花内生真菌菌株ITS基因系列如下：1        TCCTCCGGCC TTATTGATAT GCTTAAGTTC AGCGGGTCTT CCTACCTGAT51       CCGAGGTCAA CCTTGGGTTA AAAGGTGGTT TAACGGCCGG AACCCGCGGC101      GCGACCAGAG CGAGATGTAT GCTACTACGC TCGGTGCGAC AGCGAGCCCG151      CCACTGCTTT TCAGGGCCTG CGGCAGCCGC AGGTCCCCAA CACAAGCCCG201      GGGGCTTGAT GGTTGAAATG ACGCTCGAAC AGGCATGCCC GCCAGAATGC251      TGGCGGGCGC AATGTGCGTT CAAAGATTCG ATGATTCACT GAATTCTGCA301      ATTCACATTA CTTATCGCAT TTCGCTGCGT TCTTCATCGA TGCCAGAACC351      AAGAGATCCG TTGTTGAAAG TTTTGACTTA TTCAGTACAG AAGACTCAGA401      GAGGCCATAA ATTATCAAGA GTTTGGTGAC CTCCGGCGGG CGCCCGCGGT451      GGGGCCCAGG GGCGCCCGGG GGGTAAACCC CGGGGCCGCC CGCCGAAGCA501      ACGGTATAGG TAACGTTCAC AATGGTTTAG GGAGTTTTGC AACTCTGTAA551      TGATCCCTCC GCTGGTTCAC CAACGGAGAC CTTGTTACGA CTTTTTACTT601      CC加拿大一枝黄花内生真菌菌株ITS基因组由602个碱基（bp）组成。