[发明专利]加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种其发酵物具有抑制植物病原真菌的活性的微生物的分离纯化方法，即加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法。 

背景技术

在农业生产过程中控制农作物病虫草害的主要手段是化学农药防治，其对减轻病虫草危害，保证粮食丰产丰收，起到积极的作用。但是由于自然界生物之间相互依存、相互制约，过分依赖化学农药的毒杀作用，产生一些地区发生盲目滥施农药的现象，特别是一些残效期长和毒性大的农药使用，导致一系列食品安全、人类健康和生存环境问题。目前化学防治的危害逐步被人们所认识，研制安全、高效、环保的新型农药已成为发展的方向和研究的主题。生物农药因对人、畜低危险性，使用安全，对环境友好，不易产生抗性等优点，成为新农药产业发展的热点和重点。 

植物内生真菌(Endophytic fungi)是指生活在植物组织内或生活史中的某一阶段生活在植物组织内，对植物组织不引起明显变化的真菌，包括那些生活史中某一阶段能营造表生生活的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌(Latent pathogens) 和菌根菌(Mycorhiza fungi) 。植物内生真菌具有明显的多样性和普遍性。在目前所有研究过内生真菌的植物中，都有其存在，少则十几种，多则近百种。植物内生真菌与宿主植物长期的共生过程中，构建了内生真菌特殊的生长环境，使得内生真菌能够产生许多与结构新颖、生理活性独特的天然化合物。具有安全、无残留、不在人畜体内积累、防治效果专一等优点，为农药先导化合物和新型生物农药的研究和应用开拓了美好前景。当前利用植物中分离的内生真菌获得生理活性物质已成为研究热点，已有多项研究表明植物内生真菌能产生新型的抑菌活性的物质。如White等从禾本科植物中分离的内生真菌枝顶孢（Acremonium coenophilum）对多种体外培养的农作物病原真菌有抑制作用。Findlay从黑云杉(Picea mariana)中分离到内生真菌(Conoplea elegantala)的液体发酵产物中分离出两个新的苯并吡咯类活性成分，对由丝核菌(Rhizoctonia spp.)和镰刀菌(Fusarium spp.)引起的病害有很好的防效，水稻立枯病、恶苗病等病害有良好的防治作用。顾爱国从苦皮藤内生真菌(Fusarium proliferatum)中分离到恩镰孢菌素(eniatinns)类化合物，其对植物病原真菌菌丝生长和孢子萌发均有显著抑制作用。 

加拿大一枝黄花（Solidgo canadensis）作为一种外来物种，繁殖力极强，传播速度快，生长优势明显，生态适应性广阔，与周围植物争阳光、争肥料，直至其它植物死亡，从而对生物多样性构成严重威胁。加拿大一枝黄花可做观赏切花、饲料、蜜源，同时可用于天然色素的生产和提炼精油。目前, 已经发现加拿大一枝黄花体内具有较强的抗氧化、自由基消除活性和多种抑菌活性的黄酮类成分。此外还有报道加拿大一枝黄花的植物浸提液对许多杂草（如光头稗和大狗尾草）及多种蔬菜（紫花苜蓿、红苋菜、小麦、大豆和棉花 ）的种子萌发及幼苗生长具有显著的化感作用。根据植物内生真菌内共生理论，加拿大一枝黄花很有可能存在着特殊的内生真菌，通过产生特殊的具有抗菌活性的次生代谢产物。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种从中国安徽省合肥市加拿大一枝黄花 (Solidgo canadensis) 植物活体中，分离其发酵产物具有较强的抑制植物病原真菌活性的微生物，即加拿大一枝黄花内生真菌的分离纯化方法。 

本发明所述加拿大一枝黄花内生真菌命名为球毛壳yt03（Chaetomium globosum yt03），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5088； 

加拿大一枝黄花内生真菌具体的分离纯化操作步骤如下：

（1）.采集加拿大一枝黄花的茎和叶；