[发明专利]分离和扩增脐带新鲜组织间充质干细胞的方法

摘要

本发明涉及从脐带中分离和扩增间充质干细胞的方法。其包括如下步骤：对脐带组织进行消毒和清洗，将组织剪成块状，消化处理1-2.5小时，终止消化，对消化得到的细胞进行细胞清洗，获得细胞悬液，将细胞悬液加入T25细胞培养瓶里培养，培养至第3-6天并进行补，继续培养，在第8-11天时进行第一次全换液，此后每1-3天进行一次全换液；当平皿内的贴壁细胞融合率达到50-70%左右时，使用消化酶使贴壁细胞脱离T25细胞培养瓶底部；离心去上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天换液一次，直至融合率达到70-90%后，即得脐带间充质干细胞。本发明方法可有效用于分离和扩增间充质干细胞。

主权项

从脐带新鲜组织中分离和扩增间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)消毒和清洗：用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；(2)消化处理：将步骤(1)得到的脐带组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液(例如其非限制性地包含I型胶原酶、DMEM‑F12)中，消化处理0.5‑3小时(例如1‑2小时，例如1.5小时)，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2‑7天(例如第3‑6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(例如3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8‑11天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1‑3天(例如2天)进行一次全换液；(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%‑70%(例如60%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1‑3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70‑90%(例如80%)后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代；以及任选的下列一个或多个步骤：(5)针对步骤(4)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA‑ABC/DR配型；(6)将步骤(4)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。