[发明专利]分离和扩增脐带新鲜组织间充质干细胞的方法

权利要求书

1.从脐带新鲜组织中分离和扩增间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(1)消毒和清洗：用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；

(2)消化处理：将步骤(1)得到的脐带组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液(例如其非限制性地包含I型胶原酶、DMEM-F12)中，消化处理0.5-3小时(例如1-2小时，例如1.5小时)，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；

(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(例如3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天(例如2天)进行一次全换液；

(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%-70%(例如60%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%(例如80%)后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代；

以及任选的下列一个或多个步骤：

(5)针对步骤(4)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；

(6)将步骤(4)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。

2.根据权利要求1的方法，其中所述脐带是脐带的新鲜离体组织。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，剪碎的组织是大小约0.2-2.5立方厘米。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，消化处理的时间为1-2.5小时。

5.根据权利要求1的方法，其中所述间充质干细胞培养基中包含FBS、L-Glutamine、Gentamicin和DMEM-F12。

6.根据权利要求1的方法，其中：

所述间充质干细胞培养基中含有10-20%的FBS；

所述间充质干细胞培养基中含有0.5-2%的L-Glutamine；

所述间充质干细胞培养基中含有0.02-0.1%的Gentamicin；和/或

所述间充质干细胞培养基中含有80-90%的DMEM-F12。

7.根据权利要求1的方法，其中所述间充质干细胞培养基中含有约15重量份的FBS、约1重量份的L-Glutamine、约0.05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12。