[发明专利]分离和扩增脐带新鲜组织间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及从脐带新鲜组织中分离和扩增干细胞的方法，特别涉及从脐带新鲜组织中分离和扩增间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。

MSC在骨髓中蕴含丰富，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓MSC的临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。

近期的研究显示，脐带组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令脐带间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。

但是，目前关于脐带MSC的分离和扩增方法不一，且大多步骤复杂，获得较多数量脐带MSC也存在一定困难。因此，本领域需要有从脐带中分离和扩增间充质干细胞的简单、有效的方法，以满足医药、科研、临床应用等领域的需求。

发明内容

本发明的目的是解决现有获取脐带间充质干细胞方法的缺陷，提供一种简单有效的从离体脐带中分离和扩增间充质干细胞的方法。本发明发现使用一种组织消化法可以有效地从脐带组织分离原代间充质干细并进行培养。本发明基于此发现而得以完成。

因此，本发明第一方面提供了从脐带离体新鲜组织中分离和扩增间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(1)消毒和清洗：用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；

(2)消化处理：将步骤(1)得到的脐带组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液(例如其非限制性地包含I型胶原酶、DMEM-F12)中，消化处理0.5-3小时(例如1-2小时，例如1.5小时)，过滤清除组织块后，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗，最终获得细胞悬液；

(3)细胞培养：将步骤(2)得到的细胞悬液放入培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天(例如第3-6天，例如第4天，例如第5天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(例如3ml)间充质干细胞培养基，继续培养；在第8-11天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养；往后每1-3天(例如2天)进行一次全换液；

(4)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%-70%(例如60%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%(例如80%)后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代；

以及任选的下列一个或多个步骤：

(5)针对步骤(4)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；

(6)将步骤(4)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。

根据本发明第一方面的方法，其中所述脐带是脐带的新鲜离体组织。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所述脐带组织是在生物安全柜内进行处理。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所述平铺的步骤是将脐带组织平铺在培养平皿内，所述培养平皿直径为5-20cm的培养平皿，优选培养皿直径为10cm的培养平皿。

根据本发明第一方面的方法，其中所述酒精的浓度为25%-95%，优选75%。