[发明专利]一种微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法

摘要

本发明提供了一种微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，包括如下具体步骤：选择导入载体所需要的种细胞；转瓶繁殖细胞传代；收获转瓶中的细胞；细胞接种微载体；生物反应器培养接种细胞；收集长满细胞的微载体然后接种禽流感病毒-胰酶；培养禽流感病毒-胰酶；收集禽流感病毒液。该方法解决微载体培养细胞繁殖禽流感病毒过程出现的载体丢失、血清清洗不干净、接毒不均匀甚至接不上禽流感病毒等问题。

主权项

微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，其特征在于，包括如下具体步骤1：选择导入载体所需要的种细胞MDCK或者Vero；2：转瓶繁殖细胞传代的方法：首先复苏步骤1所选择的种细胞到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照1：4的比例进行传代；然后把4个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞传到1个15L转瓶进行培养；48小时左右按照1：4或1：3的比例进行细胞传代培养；3：收获转瓶中的细胞：将步骤2所得细胞用PBS洗涤2‑3次，然后加入胰酶‑EDTA溶液消化；15L转瓶加入100‑150ml胰酶‑EDTA溶液，其它类型的转瓶按照类似比例添加胰酶‑EDTA溶液消化，然后收集细胞；4：收获的细胞计数后，按照每个微载体添加5‑20个细胞的比例进行细胞接种；每升培养基中加入2‑10克微载体；5：生物反应器培养接种细胞：生物反应器投放载体的量为2‑10克/升；生物反应器培养细胞的培养基为MEM（Hyclone）；血清使用浓度为7‑10%；CO2通气量为5‑10%；溶氧量为40‑60%的溶液饱和溶氧量；温度为37℃；搅拌速度为30‑55转/分，pH为6.8‑7.4；90‑95%以上的微载体在细胞接种后48‑72h期间能够达到接种禽流感病毒的要求；6：步骤5培养的细胞达到接种禽流感病毒的要求后，进行下述步骤：在搅拌的状态下，通过虹吸的原理，把生物反应器中的培养基连带微载体一起转移到放置有150‑250目不锈钢筛网的容器中，该容器顶部含有三通孔，能够控温37℃，容器下部装有与容器紧密固定在一起的不锈钢筛网，该容器的底部含有一个排液出口；容器中的培养基通过排液出口排掉；然后用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并通过容器的底部排液出口排出PBS；7：然后关闭排液出口，把禽流感病毒‑胰酶接种液加入到步骤6所得收集有微载体的容器中，同时连通容器的底部阀门和顶部三通管的一个孔，并且使用蠕动泵缓慢的泵禽流感病毒‑胰酶接种液使其在长满细胞的微载体上慢慢的循环流动，以便病毒均匀接种；8：细胞接种病毒后，向步骤7所得装有微载体的容器加入不含血清的MEM培养基，并利用虹吸的原理通过虹吸使微载体连同培养基一起加入到生物反应器中，然后进行病毒繁殖，病毒在生物反应器中繁殖的条件为：培养基为MEM（Hyclone）； CO2通气量为5‑10%；溶氧量为40‑60%的溶液饱和溶氧量；温度为37℃；搅拌速度为30‑45转/分，pH为6.5‑7.2;9：收集禽流感病毒液。