[发明专利]一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法

摘要

本发明公开了一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法包括灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解及其水解产物单、寡糖组分的离子色谱指纹分析与标准指纹图谱的确定。通过对20个不同产地的灵芝孢子粉样品的多糖成分的HPAEC分析及其指纹图谱的比较，确定了其共有指纹特征，分别得到单、寡糖组分的标准指纹图谱，确定了单糖图谱中的11个单糖共有特征峰，以及寡糖图谱中的4个寡糖共有峰和1个多糖峰。本方法稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从反映孢子粉多糖组成和结构特征的酸-酶部分水解产物的单糖组分与寡糖组分指纹图谱两个方面把握灵芝孢子粉多糖质量情况及产地来源，为灵芝孢子粉的质量控制和真伪鉴别提供了一种新的科学方法。

主权项

一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝孢子粉多糖的酸‑酶部分水解、水解产物中单、寡糖组分的离子色谱的指纹分析及其标准指纹图谱的确定，具体步骤为：（1）灵芝孢子粉多糖的提取：对于破壁孢子粉，准确称取样品0.5‑1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60‑80℃功率300瓦超声30‑60min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，50‑60℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液待测；对于未破壁孢子粉，称取5g左右的样品于研钵中，研磨10min后准确称取其样品0.5‑1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60‑80℃功率300瓦超声30‑60min，后续操作同上；（2）灵芝孢子粉多糖的酸‑酶部分水解：吸取500μL步骤（1）所得的粗多糖水溶液，加入500μL1‑3mol/L的H2SO4溶液，漩涡混匀，于80‑100℃酸水解1‑3h，冷却至室温，用碳酸钡中和，12000r/min离心15min。取其上清液100μL，加入一定量酵母裂解酶溶液，再用0.05mol/L，pH为6.5的醋酸‑醋酸钠缓冲液补加至反应体积为1mL；于45℃下反应12h；酶解液100℃加热5min终止反应；12000r/min离心30min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，其滤液用于下步离子色谱分析；（3）灵芝孢子粉多糖部分水解产物的离子色谱指纹分析：针对酸‑酶水解物中的单糖组分，离子色谱分析条件为：色谱柱：CarboPac PA‑20，包括3×150mm分析柱和3×50mm保护柱；脉冲安培电化学检测器ED40；金工作电极；Ag/AgCl参比电极；四电位波形；流速：0.5mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；流动相：水‑0.25mol/L NaOH溶液‑1mol/LNaAc溶液，三元梯度洗脱：0～21min，97.6％A，2.4％B，0％C；21.1min，92.6％A，2.4％B，5.0％C；30min，77.6％A，2.4％B，20％C；30.1～50min，20％A，80％B，0％C；针对酸‑酶水解物中的寡糖组分，离子色谱分析条件为：色谱柱：CarboPac PA‑200，包括3×150mm分析柱和（3×50mm）保护柱；脉冲安培电化学检测器ED40；金工作电极；Ag/AgCl参比电极；四电位波形；流速：0.5mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；流动相：水‑0.25mol/LNaOH溶液‑1mol/LNaAc溶液，三元梯度洗脱：0min，57.6％A，38.4％B，4.0％C；40min，36％A，24％B，40％C;40.1～60min，57.6％A，38.4％B，4.0％C；（4）标准指纹图谱的确定：通过20个不同产地的灵芝孢子粉样品的多糖酸‑酶水解产物中单、寡糖组分的离子色谱测定，分别构建灵芝孢子粉多糖水解物中单糖组分和寡糖组分的HPAEC标准指纹图谱，确定单糖图谱中的11个单糖共有特征峰，以及寡糖图谱中的4个寡糖共有峰和1个多糖峰。