[发明专利]一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种灵芝孢子粉多糖的离子色谱指纹图谱的构建方法，属于中药及其制品和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域。

背景技术

灵芝是属于真菌门，担子菌纲，多孔菌科，灵芝科，灵芝属的真菌。我国药典规定可入药的灵芝有赤芝[Ganoderma lucidum（Leyss.exFr）Karst.]和紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）；国家食品药品监督管理局公布的可用于保健食品的灵芝品种有赤芝、紫芝和松衫灵芝（Ganoderma tsugae Murr）。灵芝孢子（Ganoderma lucidum spore）是灵芝(一般为赤芝)成熟期从菌盖弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞，生物学上称孢子，集中起来后呈粉末状，通称灵芝孢子粉。灵芝孢子具有免疫调节、抗肿瘤、调节血脂、降血糖等多种生理功效，故在近年来其市场甚为火热。但因缺乏科学全面的检测方法和质量标准，灵芝孢子粉及其加工产品的质量良莠不齐，难以有效控制和鉴别。目前已有灵芝孢子脂溶性成分指纹图谱分析方法的专利，也已有本专利申请人关于灵芝孢子粉水溶性成分即多糖的水解物的柱前PMP衍生-反相HPLC指纹图谱的专利及其分析方法的研究论文的报道。但柱前PMP衍生-反相HPLC指纹图谱的专利方法由于仅使用酸水解，水解选择性单一，加之PMP衍生-反相HPLC分析中寡糖组分的检测灵敏度不高，故该法指纹图谱中反映结构特性的寡糖组分信息不够丰富。因此，故本专利拟将酸水解和酶水解结合进行，再对得到的单糖组分和多糖组分分别分析，综合两个部分的分析结果以更灵敏、更全面地表征灵芝多糖及灵芝孢子粉产品的特征和差异，为我国灵芝孢子粉的质量检测方法和质量标准的提升及完善进一步提供科学依据与参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法，借此可将灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱作为灵芝孢子粉类产品的质量控制和真伪鉴别的主要指标之一。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：提取灵芝孢子粉多糖后，采用酸-酶部分水解灵芝孢子粉多糖，最后通过离子色谱分析构建水解产物中单、寡糖组分的标准指纹图谱。

本发明的技术方案具体包括下列步骤：

（1）灵芝孢子粉多糖的提取：

对于破壁孢子粉，准确称取样品0.5-1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60-80℃功率300瓦超声30-60min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，50-60℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液待测；

对于未破壁孢子粉，称取5g左右的样品于研钵中，研磨10min后准确称取其样品0.5-1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60-80℃功率300瓦超声30-60min，后续操作同上。

（2）灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解：

吸取500μL步骤（1）所得的粗多糖水溶液，加入500μL 1-3mol/L的H₂SO₄溶液，漩涡混匀，于80-100℃酸水解1-3h，冷却至室温，用碳酸钡中和，12000r/min离心15min。取其上清液100μL，加入酵母裂解酶溶液（100u/mg）50μL，再用0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 6.5）补加至反应体积为1mL。于45℃下反应12h。酶解液100℃加热5min，终止反应。12000r/min离心30min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，其滤液用于下步离子色谱分析。

（3）灵芝孢子粉多糖部分水解产物的离子色谱指纹分析：

针对酸-酶水解物中的单糖组分，离子色谱分析条件为：色谱柱：CarboPac PA-20，包括分析柱（3×150mm）和保护柱（3×50mm）；脉冲安培电化学检测器ED40；金工作电极；Ag/AgCl参比电极；四电位波形；流速：0.5mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；流动相：A(水)-B(0.25mol/L NaOH溶液)-C(1mol/LNaAc溶液)，三元梯度洗脱：0~21min,97.6%A,2.4%B,0%C;21.1min,92.6%A,2.4%B,5.0%C;30min,77.6%A,2.4%B,20%C;30.1~50min,20%A,80%B,0%C.