[发明专利]一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法

权利要求书

1.一种灵芝孢子粉多糖离子色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解、水解产物中单、寡糖组分的离子色谱的指纹分析及其标准指纹图谱的确定，具体步骤为：

（1）灵芝孢子粉多糖的提取：

对于破壁孢子粉，准确称取样品0.5-1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60-80℃功率300瓦超声30-60min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，50-60℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液待测；

对于未破壁孢子粉，称取5g左右的样品于研钵中，研磨10min后准确称取其样品0.5-1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60-80℃功率300瓦超声30-60min，后续操作同上；

（2）灵芝孢子粉多糖的酸-酶部分水解：

吸取500μL步骤（1）所得的粗多糖水溶液，加入500μL1-3mol/L的H₂SO₄溶液，漩涡混匀，于80-100℃酸水解1-3h，冷却至室温，用碳酸钡中和，12000r/min离心15min。取其上清液100μL，加入一定量酵母裂解酶溶液，再用0.05mol/L，pH为6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液补加至反应体积为1mL；于45℃下反应12h；酶解液100℃加热5min终止反应；12000r/min离心30min，取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，其滤液用于下步离子色谱分析；

（3）灵芝孢子粉多糖部分水解产物的离子色谱指纹分析：

针对酸-酶水解物中的单糖组分，离子色谱分析条件为：色谱柱：CarboPac PA-20，包括3×150mm分析柱和3×50mm保护柱；脉冲安培电化学检测器ED40；金工作电极；Ag/AgCl参比电极；四电位波形；流速：0.5mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；流动相：水-0.25mol/L NaOH溶液-1mol/LNaAc溶液，三元梯度洗脱：0～21min，97.6％A，2.4％B，0％C；21.1min，92.6％A，2.4％B，5.0％C；30min，77.6％A，2.4％B，20％C；30.1～50min，20％A，80％B，0％C；

针对酸-酶水解物中的寡糖组分，离子色谱分析条件为：色谱柱：CarboPac PA-200，包括3×150mm分析柱和（3×50mm）保护柱；脉冲安培电化学检测器ED40；金工作电极；Ag/AgCl参比电极；四电位波形；流速：0.5mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；流动相：水-0.25mol/LNaOH溶液-1mol/LNaAc溶液，三元梯度洗脱：0min，57.6％A，38.4％B，4.0％C；40min，36％A，24％B，40％C;40.1～60min，57.6％A，38.4％B，4.0％C；

（4）标准指纹图谱的确定：

通过20个不同产地的灵芝孢子粉样品的多糖酸-酶水解产物中单、寡糖组分的离子色谱测定，分别构建灵芝孢子粉多糖水解物中单糖组分和寡糖组分的HPAEC标准指纹图谱，确定单糖图谱中的11个单糖共有特征峰，以及寡糖图谱中的4个寡糖共有峰和1个多糖峰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述11个单糖共有特征峰分别对应岩藻糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸；所述寡糖指纹图谱中的5个共有特征峰分别对应三糖、五糖、六糖、七糖和多糖。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述酵母裂解酶用量为100u/mg 50μL。