[发明专利]硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体及其细胞系

摘要

本发明涉及硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物技术领域。将SQR基因插入真核表达载体pcDNA3.1(-)，构建慢病毒重组载体Lanti4-blockit-IFABP-SQR-GFP，将其感染原代培养的猪小肠上皮细胞，构建特异表达SQR-GFP蛋白的真核细胞系。为进一步开展体细胞核移植克隆转SQR基因胚胎制备，培育减少污染物排放的转基因猪新品种提供必要的转基因生物材料和关键技术体系支撑。

主权项

硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的： (1)以原核载体pRSETA‑SQR为模板，根据SQR基因序列，设计PCR引物P1和P2，P2 3’端引入Myc‑Tag序列：P1: 5’‑CCGCTCGAGATGGCTCATATCGTGGTTCTGGG‑3’  Xho IP2:5’‑GGGGTACCTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCCCCTTCTTCACGGCCTTCA‑3’   Kpn IPCR 扩增条件为：98℃，5min；98℃，10s；55℃，100s；72℃，80s；30个循环；72℃，5min，扩增片段大小为1331bp；将上述PCR终产物与pMD‑18T使用T4 DNA连接酶4℃连接，得到克隆载体pMD18T‑SQR‑Myc； (2)将上述克隆载体pMD18T‑SQR‑Myc用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用相同限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(‑)，将酶切回收的SQR‑Myc目的片段和pcDNA3.1(‑)载体片段由T4 DNA连接酶16℃连接过夜，得到SQR真核表达载体pcDNA3.1(‑)‑SQR‑Myc；    (3)根据SQR基因及GFP基因序列，设计PCR反应引物 P3 / P4 和 P5 / P6，引物 P3/P4 扩增 SQR‑Myc，引物 P5/P6 扩增 GFP，P4有部分序列与 GFP基因互补，同时P5有部分序列与SQR‑Myc基因片段互补；P3: 5’‑CCGCTCGAGAATGGCTCATAT‑3’   Xho IP4: 5’‑CCTTGCTCACCATCAGATCCTCTTCTGA‑3’P5: 5’‑GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG‑3’P6: 5’‑GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA‑3’   Kpn I以pMD18T‑SQR‑Myc载体为模板，使用引物P3/P4，扩增SQR‑Myc片段，大小为1334bp；以质粒pEGFP‑C3为模板，使用引物P5/P6，扩增GFP片段，大小为744bp；以上述扩增产物SQR‑Myc片段及GFP片段为模板，用引物P3和P6，采用重叠PCR方法将两种组件融合，得到SQR‑GFP片段，该融合片段的大小为2048bp，扩增程序为98℃，4min；98℃，10s；52℃，10s；72℃，130s；30个循环；72℃，10min；利用T4 DNA连接酶将上述PCR终产物SQR‑GFP片段与pMD‑18T 在4℃条件下连接，获得重组载体pMD18T‑SQR‑GFP； (4)将中间载体pMD18T‑SQR‑GFP用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用同样的限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(‑)，将酶切回收的SQR‑GFP目的片段和pcDNA3.1(‑)载体片段采用T4 DNA连接酶连接16℃过夜，获得真核表达载体pcDNA3.1(‑)‑SQR‑GFP；(5)根据Genebank中IFABP启动子序列设计PCR引物P7、P8，扩增IFABP启动子片段，扩增的程序为：98℃，4min；98℃，10s；55℃，10s；72℃，80s；30个循环；72℃，5min，获得IFABP片段的大小为1352bp；P7: 5’‑CGGCTAGCACGAACATTGACTGGAGT  Nhe IP8: 5’‑GCTCTAGATACTTTCCAAGTGCCATC   Xba I将上述获得的IFABP片段TA克隆到载体pMD‑18T上，获得重组载体pMD18T‑IFABP，并采用Nhe I和Xba I进行双酶切，将回收得到的IFABP片段克隆到pcDNA3.1‑SQR‑GFP相应的酶切位点，获得重组载体pcDNA3.1‑IFABP‑SQR‑GFP。