[发明专利]筛选肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物方法

摘要

本发明公开了一种筛选肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物方法，包括原代肝星状细胞的分离培养和体外培养自动激活模型、静止和激活肝星状细胞蛋白样品的制备步骤。本发明方法简单、易操作。

主权项

一种筛选肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物方法，其特征是：包括下列步骤：(1)原代肝星状细胞的分离培养和体外培养自动激活模型：将原代肝星状细胞以0.04％台盼蓝染色并进行细胞计数和活力检测，然后以含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培液稀释，调整细胞密度为106细胞/ml，接种于细胞培养瓶或培养板中，置于含5％CO2，95％空气的37℃培养箱中培养，次日换液，以后每48hr换液，3‑4天传代；通过UV激发波长观察肝星状细胞胞浆中维素A脂滴的自发荧光、苏丹III脂肪染色及免疫荧光检测大鼠肝星状细胞特异性标志结蛋白，所获原代肝星状细胞纯度高于90％；体外培养第2‑3天的肝星状细胞胞浆富含脂滴，为处于静止状态；第10天的肝星状细胞脂滴大部分丢失，表达α‑平滑肌肌动蛋白和I型胶原，为处于激活状态；(2)静止和激活肝星状细胞蛋白样品的制备：0.25％胰蛋白酶分别消化静止状态肝星状细胞及激活状态肝星状细胞，用4℃预冷的PBS洗3次，400×g离心5min，弃上清，按每106个细胞100μl用量加入细胞裂解液，4℃15000g离心20min，取上清，Brandford法测定蛋白浓度，分装、‑80℃保存备用；将来源于静止状态肝星状细胞和激活状态肝星状细胞的细胞总蛋白各100μg中，分别加入终浓度为8～10mmol/L二硫代苏糖醇，37℃1h还原，再加入终浓度为20～25mmol/L碘乙酰胺室温避光30min进行烷基化修饰，最后用pH8.0的90～100mmol/L三‑(羟甲基)氨基甲烷盐酸稀释上述样品使 尿素浓度低于2mol/L，加入测序级胰蛋白酶，37℃孵育16h酶解，得到肝星状细胞激活及肝纤维化相关蛋白生物标志物；测序级胰蛋白酶与蛋白的质量比为1∶50；(3)iTRAQ结合2D nanoLC‑MS/MS的差异蛋白组学分析：经烷基化和酶解的静止和激活肝星状细胞蛋白样品分别用分子量114和116的iTRAQ试剂标记，室温孵育1h后，两组标记了iTRAQ试剂的蛋白样品混合、经阳离子交换柱进一步纯化后进行在线二维纳升级串联液相质谱分析；所得质谱数据通过ProteinpilotTM软件搜索IPI非冗余数据库，参数设定如下：MS允许误差范围为0.10～0.15amu，MS/MS允许误差范围为0.1amu，酶漏切位点为1，固定修饰为半胱氨酸甲基化修饰，蛋白鉴定标准为得分大于1.3，对肽和蛋白进行鉴定和定量分析。