[发明专利]鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒

摘要

本发明涉及一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，其特征在于：将待检血清用样品稀释液2倍稀释后100ul加入ELISA板中37℃孵育1h，用洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入结合单抗每孔100ul，37℃孵育1h，洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入羊抗小鼠IgG-HRP结合物37℃作用1h，洗涤液清洗5次，每次2min；然后加入显色底物溶液，将底物A和底物B以1：1混合，100ul加入ELISA孔中，避光显色15min，加入50ul终止液，测其OD490值。该试剂盒方法技术成熟，重复性强，能够有效鉴别经典猪蓝耳病与高致病性猪蓝耳病抗体，一般研究人员即可完成。

主权项

一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，由96孔ELISA板、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、羊抗小鼠IgG‑HRP结合物、结合单抗、终止液、底物A、底物B、阳性样品、阴性样品、盖板膜用相应的广口瓶加以封装，贴上标签，组装成试剂盒；其中样品稀释液为NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4 ·12H2O 2.9g；KCl 0.2g补加二馏水至1000ml；加入0.5ml Tween‑20，最后50ml分装；20倍浓缩洗涤液为NaCl 160.0g；KH2PO4 4g；Na2HPO4 ·12H2O 58g；KCl 4g补加二馏水致1000ml；加入10ml Tween‑20，最后50ml分装；羊抗小鼠IgG‑HRP结合物为10ml PBST加入2ul羊抗小鼠IgG‑HRP二抗，然后加入4%PEG，25ml分装；终止液为2mol/L H2SO4  浓硫酸44.5ml，双蒸水355.5ml，10ml分装；底物A为TMB 200mg，无水乙醇100ml，加双蒸水至1000ml，10ml分装；底物B为（0.1ml/L柠檬酸‑0.2ml/L磷酸氢二纳，pH5.0‑5.4）：Na2HPO4 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75%过氧化氢尿素6.4ml，加三蒸水至1000ml，调至pH5.0‑5.43，10ml分装；阳性样品为将标准PRRSV阳性血清1：5稀释于样品稀释液中，1ml分装；阴性样品为将PRRSV阴性血清1：5稀释于样品稀释液中，1ml分装；其特征在于：结合单抗将纯化的抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单抗2B9 以60000倍稀释于PBS中加入4%PEG，25ml分装；其制备方法如下：首先制备抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单克隆抗体，利用杂交瘤技术通过细胞融合、细胞克隆筛选建立的抗经典PRRSV单克隆抗体2B9，所制备单抗只针对经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸，而对高致病性PRRSV无特异性反应，这就决定了试剂盒的特异性；    所述的96孔ELISA板上包被的抗原为由公司合成的经典蓝耳病Nsp2蛋白区特有的30个氨基酸，用包被缓冲液将抗原稀释到0.7ug/mL，37℃包被1h后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭1h，PBS洗涤5次干燥后用铝箔真空密封。