[发明专利]鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，由96孔ELISA板、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、羊抗小鼠IgG-HRP结合物、结合单抗、终止液、底物A、底物B、阳性样品、阴性样品、盖板膜用相应的广口瓶加以封装，贴上标签，组装成试剂盒；

其中样品稀释液为NaCl 8.0g；KH₂PO₄ 0.2g；Na₂HPO₄ ·12H₂O 2.9g；KCl 0.2g补加二馏水至1000ml；加入0.5ml Tween-20，最后50ml分装；

20倍浓缩洗涤液为NaCl 160.0g；KH₂PO₄ 4g；Na₂HPO₄ ·12H₂O 58g；KCl 4g补加二馏水致1000ml；加入10ml Tween-20，最后50ml分装；

羊抗小鼠IgG-HRP结合物为10ml PBST加入2ul羊抗小鼠IgG-HRP二抗，然后加入4%PEG，25ml分装；

终止液为2mol/L H₂SO₄  浓硫酸44.5ml，双蒸水355.5ml，10ml分装；

底物A为TMB 200mg，无水乙醇100ml，加双蒸水至1000ml，10ml分装；

底物B为（0.1ml/L柠檬酸-0.2ml/L磷酸氢二纳，pH5.0-5.4）：Na₂HPO₄ 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75%过氧化氢尿素6.4ml，加三蒸水至1000ml，调至pH5.0-5.43，10ml分装；

阳性样品为将标准PRRSV阳性血清1：5稀释于样品稀释液中，1ml分装；

阴性样品为将PRRSV阴性血清1：5稀释于样品稀释液中，1ml分装；

其特征在于：结合单抗将纯化的抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单抗2B9 以60000倍稀释于PBS中加入4%PEG，25ml分装；

其制备方法如下：首先制备抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸的单克隆抗体，利用杂交瘤技术通过细胞融合、细胞克隆筛选建立的抗经典PRRSV单克隆抗体2B9，所制备单抗只针对经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸，而对高致病性PRRSV无特异性反应，这就决定了试剂盒的特异性；

    所述的96孔ELISA板上包被的抗原为由公司合成的经典蓝耳病Nsp2蛋白区特有的30个氨基酸，用包被缓冲液将抗原稀释到0.7ug/mL，37℃包被1h后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭1h，PBS洗涤5次干燥后用铝箔真空密封。

2.根据权利要求1中所述的一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，其特征在于所述的ELISA试剂盒的检测方法是样品中抗经典PRRSV特有抗原的抗体与包被抗原结合阻碍了结合单抗与包被抗原的结合，通过酶标抗体形成“包被抗原+结合单抗+酶标抗体”复合物，加入显色剂，通过酶催化反应显色，显色深浅与样品中的检测抗体含量成反比；当抑制率超过设定的临界值时结果判为阳性，表明有抗经典PRRSV抗体存在；判定结果是这样设定的：抑制率PI=(OD未抑制-OD样品) /OD未抑制*100%，PI>20%对应的样品为阳性，小于则为阴性。