[发明专利]鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病的试剂盒，特别是涉及一种能够鉴别经典猪蓝耳病与高致病性猪蓝耳病的液相阻断ELISA制备方法，属于一种新的动物疫病诊断试剂，主要用于临床猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病、PRRS）与高致病性猪蓝耳病（HPRRS）的鉴别诊断及流行病学调查；应用于畜牧兽医学领域。

背景技术

猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的一种传染病。本病于1987年首先爆发于美国，随后迅速传到世界各地，现已成为危害规模化养猪生产的重要疫病之一。而2001年至今，我国每年都有部分地区不同程度的受到猪“高热病”的危害，经一系列的研究表明，引起“高热病”的最主要病原为变异的高致病性的PRRSV。仅根据临床症状和病变及流行病学特点很难做出诊断，因此PRRS的确诊需要借助实验室诊断技术，特别是新发生本病的地区和猪场。PRRSV属套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，单股正链有囊膜的RNA病毒，病毒粒子呈球形或卵圆形，直径为45~65nm，含有20~35nm的核衣壳，呈二十面体对称，外绕一脂质双层膜，表面有纤突，较小且不清楚。在我国分离的毒株属于美洲型，如VR2332株。经测序表明，与经典毒株相比，HPRRS病原的序列变化主要是在Nsp2区缺失了30个氨基酸，并且致死率明显高于经典毒株。可见，Nsp2中30个氨基酸的缺失与否，成为鉴别高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病的重要指标。

目前针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测主要采用的技术方法有：病毒分离、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、血清中和试验（SVN）、间接荧光抗体试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金技术、反转录、聚合酶链式反应（RT—PCR）、等。上述检测PRRSV抗体的技术多针对结构蛋白，而有关PRRSV非结构蛋白抗体的检测方法还未见报道，且不便于经典猪蓝耳病及高致病性猪蓝耳病的鉴别检测。这些限制了对猪蓝耳病的预防控制，因此研制出一种特异性强、灵敏度高、简单易行的诊断方法迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，基于二者差异，利用固相酶联免疫吸附试验（ELISA）原理，以经典PRRSV特有抗原为包被抗原，结合单抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG及其他配套试剂组成。其反应机理为包被抗原和样品中抗经典PRRSV特有抗原的抗体结合导致单抗和抗原的结合量减少，通过酶标抗体形成“包被抗原+结合单抗+酶标抗体”复合物，加入显色剂，通过酶催化反应显色，显色深浅与样品中的检测抗体含量成反比。当抑制率高于设定的临界值时结果判为阳性，表明有抗经典PRRSV抗体存在。判定结果是这样设定的：抑制率PI=(OD_未抑制-OD_样品) /OD_未抑制*100%，PI>20%对应的样品为阳性，小于则为阴性。具有简单、快速、敏感和特异性好等特点；适用于临床鉴别经典猪蓝耳病与高致病性猪蓝耳病。

本发明的技术方案是这样实现的：一种能够鉴别经典PRRS与HPRRS的液相阻断ELISA试剂盒，由96孔ELISA板、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、羊抗小鼠IgG-HRP结合物、结合单抗、终止液、底物A  、底物B  、阳性样品、阴性样品、盖板膜组成，其特征在于：其中结合单抗为抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸单克隆抗体2B9，其制备方法如下：首先制备抗经典猪蓝耳病Nsp2蛋白特有30个氨基酸单克隆抗体，利用杂交瘤技术通过细胞融合、细胞克隆筛选建立的抗经典PRRSV单克隆抗体2B9，所制备单抗只针对经典猪蓝耳病Nsp2蛋白中30个氨基酸，而对高致病性PRRSV抗原无特异性反应，这就决定了试剂盒的特异性；

所述的96孔ELISA板上包被的抗原为由公司合成的经典蓝耳病Nsp2蛋白区特有的30个氨基酸，用包被缓冲液将抗原稀释到0.7ug/mL，37℃包被1h后用含5%脱脂奶粉的PBS封闭1h，PBS洗涤5次干燥后用铝箔真空密封。

本发明的积极效果是