[发明专利]一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法

摘要

一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，涉及一种菌株的筛选方法。以玫瑰孢链霉菌为出发菌株，以葡萄糖、麦芽提取物、酵母提取物、CaCO3、琼脂粉作为培养基的主要原料用于培养菌株孢子，应用于菌株筛选工作。筛选所得的抗性菌株摇瓶发酵生物量达到30g/L，达托霉素产量达到59mg/L，相对原始菌株产量提高63.8％。相对于其他筛选方法，菌株筛选方法简便、高效，可用于菌株的大量筛选，对于玫瑰孢链霉菌的达托霉素生产能力有显著的提高。而达托霉素的作为一种新的脂肽类抗生素，具有很好的医用市场前景，菌株筛选方法具有显著的经济和社会意义。

主权项

一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于所述玫瑰孢链霉菌D1000‑S3‑2(Streptomyces roseosporus D1000‑S3‑2)，已于2011年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号CCTCC NO：M2011236；所述筛选方法包括以下步骤：1)将无菌水和玻璃珠装入离心管，灭菌备用；2)将DA1合成培养基平板上长好的孢子刮入离心管；3)将离心管置于振荡器上震荡，将孢子打散并均匀分散，得孢子悬液；4)配制DA1合成培养基，分装至三角瓶，灭菌备用；5)分别配制达托霉素标准液和链霉素标准液，经无菌微孔滤膜过滤后备用；6)分别取达托霉素标准液添加入DA1合成培养基，迅速倒板，制成100、200、300、400、500、600、700mg/L的达托霉素浓度梯度平板，设置不添加抗生素的平板作为对照；7)分别取链霉素标准液添加入DA1合成培养基，迅速倒板，制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/L的链霉素浓度梯度平板，设置不添加抗生素的平板作为对照；8)将步骤3)制得的孢子悬液稀释后涂布在达托霉素浓度梯度平板和链霉素浓度梯度平板上培养；9)观察达托霉素浓度梯度平板和链霉素浓度梯度平板的菌落生长情况，以与对照相比菌落有明显减少的浓度为该抗生素对菌株的最小抑制浓度；10)制备2～5倍达托霉素MIC浓度的抗性平板；11)制备2～5倍链霉素MIC浓度的抗性平板；12)制备2～5倍链霉素MIC浓度和2～5倍达托霉素MIC浓度的复合抗性平板；13)将孢子悬液稀释后涂布在步骤10)～12)所得的2～5倍达托霉素MIC浓度的抗性平板、2～5倍链霉素MIC浓度的抗性平板、2～5倍链霉素MIC浓度和2～5倍达托霉素MIC浓度的复合抗性平板上，设置不添加抗生素的平板作为对照；14)将涂布好孢子的平板培养，长出的菌落即为达托霉素与链霉素抗性突变株；15)挑取形态和颜色变化较大的突变子到同等浓度的抗性平板纯化后转接到DA1培养基上培养，进行生物活性测定实验，挑选高产菌株进行保藏。