[发明专利]一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌株的筛选方法，尤其是涉及一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法。

背景技术

达托霉素(Daptomycin)是由玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵产生的新型环状酸性脂肽类抗生素，该菌种最早由Falcao de Morias和Dailia Maia在1961年代从土耳其Ararat山土样中分离筛选得到。

达托霉素早在20世纪80年代就由礼莱公司研究人员发现并随后制成静脉针剂用于治疗革兰氏阳性菌感染。在20世纪80年代和90年代早期，进行了I期和II期试验，其中参与人员超过370名。试验发现，达托霉素对皮肤和软组织感染和菌血症的效果令人鼓舞。剂量的提高对感染性心内膜炎也有效。

1997年，Cubist公司从礼莱公司取得达托霉素的专利权，并分别在菌血病和复杂的皮肤和软组织感染中进行了I期和II期临床试验。为了满足病人对新型耐药抗生素的迫切需求，2003年底，美国食品与药物管理局(FDA)经过快速审理程序批准注射用达托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。通过静脉注射，达托霉素产生的药代动力学为线性，半衰期为8h。在各种动物模型中，达托霉素对药物敏感与耐药性革兰氏阳性菌均有效力。正在进行的第三阶段研究在每天给药一次的基础上研究达托霉素对革兰氏阳性菌引起的严重感染的药效，包括皮肤和软组织感染，群落获得性肺炎和VRE感染。其副作用小，安全性高。

玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)具有以下特征：孢子链呈直型，没有卷曲，每个链上多于10个孢子，孢子表面光滑可产生红色及浅棕色水溶性色素；在琼脂-葡萄糖平板培养基上生成质地致密、丝绒状或有皱折、干燥，不透明的白色的干粉；菌落正反面的颜色因基内菌丝和孢子所产生色素各异而不一致，因基内菌丝与培养基结合较紧，故不易挑起；且不产生水溶性色素。由于其孢子颜色为红色或红褐色，生理生化试验表明其菌物学特征与已知模式菌株不同，因此被分类定义为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)。

抗生素作为代谢终产物对其产生菌可能有几个方面的作用：1)作为终产物对参与抗生素生物合成的有关酶进行反馈调节；2)对产生菌本身有抑制、杀死作用。因此筛选产生菌对自身代谢产物的耐受性的提高，将有利于抗生素产量的提高。如：杜润泮将原始的卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)用1～10万伦琴的γ射线照射其孢子悬液后，菌株由原来耐受100～500μg/mL浓度的自身代谢产物达到耐2000～20000μg/mL高浓度的菌株，发酵单位比原始菌株分别提高33.3％。王锦经过紫外诱变处理小诺霉素产生菌，利用菌株抗自身代谢物特征选育获得小诺霉素生产突变株发酵单位比出发菌株提高了34.39％。

近年来，虽然存在玫瑰孢链霉菌选育工作的相关报导，卢文玉(卢文玉.天津大学学报，2006，39：20-14)报道了癸酸抗性突变株流加发酵法生产达托霉素的相关研究，周剑(周剑.辐射研究与辐射工艺学报，2008，26(5)：317-320)报道了利用氮离子注入玫瑰孢链霉菌选育达托霉素高产菌株的研究。但是利用联合抗性法来进行筛选一直被人们忽略。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法。

本发明的技术方案是以玫瑰孢链霉菌为出发菌株，以葡萄糖、麦芽提取物、酵母提取物、CaCO₃、琼脂粉作为培养基的主要原料用于培养菌株孢子，应用于菌株筛选工作。

本发明采用的菌种为玫瑰孢链霉菌D1000-S3-2(Streptomyces roseosporus D1000-S3-2)，已于2011年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏中心保藏编号CCTCC NO：M2011236，该菌种也可购买于美国菌种保藏中心(ATCC)，菌株编号：Streptomyces roseosporus ATCC 11379。

本发明包括以下步骤：

1)将无菌水和玻璃珠装入离心管，灭菌备用；

2)将DA1合成培养基平板上长好的孢子刮入离心管；

3)将离心管置于振荡器上震荡，将孢子打散并均匀分散，得孢子悬液；

4)配制DA1合成培养基，分装至三角瓶，灭菌备用；