[发明专利]一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法

权利要求书

1.一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于所述玫瑰孢链霉菌D1000-S3-2(Streptomyces roseosporus D1000-S3-2)，已于2011年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号CCTCC NO：M2011236；

所述筛选方法包括以下步骤：

1)将无菌水和玻璃珠装入离心管，灭菌备用；

2)将DA1合成培养基平板上长好的孢子刮入离心管；

3)将离心管置于振荡器上震荡，将孢子打散并均匀分散，得孢子悬液；

4)配制DA1合成培养基，分装至三角瓶，灭菌备用；

5)分别配制达托霉素标准液和链霉素标准液，经无菌微孔滤膜过滤后备用；

6)分别取达托霉素标准液添加入DA1合成培养基，迅速倒板，制成100、200、300、400、500、600、700mg/L的达托霉素浓度梯度平板，设置不添加抗生素的平板作为对照；

7)分别取链霉素标准液添加入DA1合成培养基，迅速倒板，制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/L的链霉素浓度梯度平板，设置不添加抗生素的平板作为对照；

8)将步骤3)制得的孢子悬液稀释后涂布在达托霉素浓度梯度平板和链霉素浓度梯度平板上培养；

9)观察达托霉素浓度梯度平板和链霉素浓度梯度平板的菌落生长情况，以与对照相比菌落有明显减少的浓度为该抗生素对菌株的最小抑制浓度；

10)制备2～5倍达托霉素MIC浓度的抗性平板；

11)制备2～5倍链霉素MIC浓度的抗性平板；

12)制备2～5倍链霉素MIC浓度和2～5倍达托霉素MIC浓度的复合抗性平板；

13)将孢子悬液稀释后涂布在步骤10)～12)所得的2～5倍达托霉素MIC浓度的抗性平板、2～5倍链霉素MIC浓度的抗性平板、2～5倍链霉素MIC浓度和2～5倍达托霉素MIC浓度的复合抗性平板上，设置不添加抗生素的平板作为对照；

14)将涂布好孢子的平板培养，长出的菌落即为达托霉素与链霉素抗性突变株；

15)挑取形态和颜色变化较大的突变子到同等浓度的抗性平板纯化后转接到DA1培养基上培养，进行生物活性测定实验，挑选高产菌株进行保藏。

2.如权利要求1所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤2)中，所述刮入离心管采用接种环刮入离心管。

3.如权利要求1所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤3)中，所述震荡的时间为3～5min。

4.如权利要求1所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤4)中，所述DA1合成培养基的组成为葡萄糖4.0g/L，麦芽提取物10g/L，酵母提取物4g/L，CaCO₃2g/L，琼脂15g/L。

5.如权利要求1所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤8)中，所述稀释的倍数为10～100倍。

6.如权利要求1所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤8)中，所述孢子悬液加入20％甘油。

7.如权利要求1所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤8)中，所述培养的条件为培养7～9天，培养温度28～30℃。

8.如权利要求1所述的一种可高产达托霉素的玫瑰孢链霉菌的筛选方法，其特征在于在步骤8)中，在步骤14)中，所述平板培养的条件于28～30℃培养箱中培养7～9天。