[发明专利]重要肠道致病病毒检测基因芯片的制备和用途

摘要

本发明涉及一种重要肠道致病病毒检测基因芯片，其制备方法包括制备特异引物，制备病毒特异性探针，制备寡核苷酸芯片，建立RT-PCR体系，建立杂交体系，制备可视化检测试剂及建立显色方法。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别10种常见肠道致病病毒，包括包括脊髓灰质炎病毒1、2、3型、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒B3、B4、B5型、埃可病毒30型、轮状病毒，为常见肠道致病病毒高通量、快速检测提供一种新的解决方案，可为肠道致病病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。

主权项

一种检测常见肠道致病病毒核酸的可视化基因芯片，其制备方法包括：1)步骤一：制备5对肠道致病病毒引物，分别放入3管RT‑PCR体系中，序列如表1所示：表1引物序列2)步骤二：制备10条病毒特异性探针和1条肠道病毒通用探针，序列如表2所示：表2探针序列3)步骤三：将步骤二中的各个寡核苷酸探针用6×SSC，0.1％SDS稀释至终浓度50μM，并点到空白的醛基化修饰玻片上，阵列如表3所示，其中片基质控探针为20T序列，5’端cy3标记、3’端NH2修饰，所有探针的点样量均为3nl，使用前至少在室温放置干燥18小时；表3寡核苷酸探针阵列  片基质控  片基质控  片基质控  片基质控  片基质控  片基质控  片基质控  片基质控  P1  P2  P3  CB3  CB4  CB5  片基质控  P1  P2  P3  CB3  CB4  CB5  片基质控  P1  P2  P3  CB3  CB4  CB5  片基质控  E30  CA16  Ro  Ev71  Ev‑3P  空白对照  片基质控  E30  CA16  Ro  Ev71  Ev‑3P  空白对照  片基质控  E30  CA16  Ro  Ev71  Ev‑3P  空白对照4)步骤四：制备RT‑PCR体系，配方如表4所示：表4RT‑PCR体系配方5)步骤五：制备杂交液，其组成为9×SSC，0.3％SDS，11％甲酰胺，11％50×Denhardt’s；制备洗液A，其组成为1×SSC，0.2％SDS；制备洗液B，其组成为0.2×SSC；制备洗液C，其组成为0.1×SSC；6)步骤六：制备可视化检测试剂，包括Streptavidin‑HRP、Biotin‑Tyramine、Streptavidin‑Nanogold、稀释液、PBST洗液、银染试剂A液和B液，其中稀释液组分为1×PBS+0.1％BSA，PBST洗液组分为1×PBS+0.05％Tween20，银染试剂A液组分为醋酸银的水溶液，浓度4mg/mL，银染试剂B液组分为氢醌的柠檬酸缓冲液溶液，浓度10mg/mL。