[发明专利]发酵法制取谷氨酸脱氢酶的工艺

摘要

本发明公开了一种高产菌株发酵制取谷氨酸脱氢酶的方法，其制备方法如下：经过谷氨酸棒杆菌发酵、制备粗酶液、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、超滤、浓缩干燥后，获得谷氨酸脱氢酶成品，其比酶活高于260U/mg，酶活回收率高于14％，纯化倍数约75倍。本发明采用上述方法制备谷氨酸脱氢酶，设备简单，方法易行，操作安全，适合工业化生产。

主权项

一种发酵法制取谷氨酸脱氢酶的工艺，其特征在于，包括如下步骤：(1)发酵：谷氨酸棒杆菌CQ920接种于普通肉汤培养基上，32℃培养36h进行活化，活化1～2次；将3‑4块0.5‑1.0cm2活化后的菌株接入灭菌冷却后的种子培养基内，32℃，180rpm培养10‑12h；培养获得的种子培养液以8％的接种量转入灭菌冷却后的发酵培养基内，控制发酵温度及通风，发酵过程中流加10％的尿素控制pH值为7.5左右，当残糖浓度降至一定值时开始加入50％的葡萄糖溶液，流加糖总时间为10h左右；(2)粗酶液的制备：菌株发酵液离心，用0.2％的KCl洗涤数次，取定量湿菌体，按比例加入pH 7.5 25mm的Tris‑HCl缓冲液，菌体悬液在4℃用超声波细胞破碎仪处理2次，每次20min，离心去沉淀，获得谷氨酸脱氢酶粗提液；(3)离子交换层析：离子交换层析工艺为：谷氨酸脱氢酶粗提液上样于25mm Tris‑HCl(pH 7.5)平衡的DEAE‑纤维素柱，用含0.2‑0.6mm NaCl的25mmTris‑HCl(pH 7.5)梯度洗脱，分步收集，合并活性部分；(4)疏水层析：离子交换层析液用PEG 6000浓缩后，上样于用含1m硫酸铵的25mm Tris‑HCl(pH 7.5)平衡的疏水柱HiPrep，用含1m硫酸铵的25mm Tris‑HCl(pH 7.5)和含50％乙二醇的25mm Tris‑HCl(pH 7.5)梯度洗脱，分步收集，合并活性部分；(5)凝胶过滤层析：疏水层析收集液用截留分子量为12000U的透析袋透析4h，用PEG6000浓缩后上样于用含0.2m NaCl的25mm Tris‑HCl(pH 7.5)平衡的凝胶过滤柱Superdex G‑200，用相同的缓冲液洗脱，分步收集，合并活性高的部分；(6)超滤：将凝胶过滤层析收集液用截留分子量10000U的超滤器于5000r/min，4℃离心5‑6h；(7)成品：取离心后上部超滤液，冷冻干燥，获得谷氨酸脱氢酶成品。