[发明专利]一种分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法

摘要

本发明提出一种本发明提出一种分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法，所述方法包括如下步骤：S1：OECs的分离培养；S2：培养皿的包被；S3：OECs的纯化；以及S4：OECs的染色鉴定。本发明的分离、培养及纯化人胚嗅鞘细胞的方法，OECs经培养2～14天后仍保持雪旺细胞的双极和三极形态，细胞排布由杂乱无章，走向排列一致；采用适量的DMSO有保护轴突及髓鞘、减少水肿、促进神经周围血液流速、稳定细胞溶酶体膜和清除自由基之功效。

主权项

一种分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法，包括下述步骤：S1：OECs的分离培养：取2‑3月龄流产胎儿，解剖显微镜下分离出两侧嗅球，移入含D‑Hank’s液的培养皿，在解剖显微镜下去除毛细血管网，将嗅球最外层的嗅神经层、小球层连同包被的软膜一起剥下；用D‑Hank’s液洗2次，用虹膜剪剪碎后用0.25％胰酶37℃消化30min，加入含血清培养液终止消化；使用200目滤网过滤去除大块组织，过滤液600g离心5min；弃上清，用含Forskolin和BPE的全培养液重悬，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于p75包被的培养皿；每2天换液1次。S2：培养皿的包被：将p75单抗用D‑Hanks液配制成1∶1000的浓度，浸没包被培养皿皿底后吸出，置超净台自然干燥后备用，用前培养液湿润。S3：OECs的纯化：培养7天后更换条件培养液，培养48小时后替换为全培养液；以及S4：OECs的染色鉴定：将纯化后生长良好的细胞，用常规方法进行免疫细胞化学染色；贴壁细胞去培养基，用PBS洗3次，经4％的多聚甲醛固定30min。PBS洗涤3次，0.3％TritonX‑100处理20min。PBS漂洗3次，10％羊血清室温封闭20mi n，吸出血清，加入鼠抗人p75IgG单抗，37℃孵育2小时后PBS洗3次，加入FITC结合的羊抗鼠IgG(1∶500)孵育30min。