[发明专利]一种分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法。

背景技术

嗅黏膜嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)能促进中枢轴突的再生。近年来嗅鞘细胞移植的研究，为中枢神经系统损伤后的再生带来希望。OECs主要分布在嗅球和嗅黏膜中，目前进行OECs移植的实验材料大多取自嗅球，获取足够数量的OECs是临床应用的前提。另外，由于OECs具有特殊的细胞形态，突起十分细长。成纤维胞不能被p75抗体标记，据此可以区分出OECs和成纤维细胞。OECs培养的最终目的是应用于临床修复脊髓损伤，这要求具有足够的细胞数，鉴于OECs的取材及培养都有难度，而且其他细胞污染难以避免，如何在保证细胞活性的前提下纯化OECs具有重要的临床意义。

发明内容

本发明提出一种分离、培养人胚OECs，并采用免疫吸附法进行纯化的方法，所述方法包括如下步骤：

S1：OECs的分离培养：取2-3月龄流产胎儿，解剖显微镜下分离出两侧嗅球，移入含D-Hank’s液的培养皿，在解剖显微镜下去除毛细血管网，将嗅球最外层的嗅神经层、小球层连同包被的软膜一起剥下。用D-Hank’s液洗2次，用虹膜剪剪碎，然后用0.25％胰酶37℃消化30min，加入含血清培养液终止消化。200目滤网过滤去除大块组织，过滤液600g离心5min。弃上清，用含Forskolin和BPE的全培养液重悬，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于p75包被的培养皿。每2天换液1次。

S2：培养皿的包被：将p75单抗用D-Hanks液配制成1∶1000的浓度，浸没包被培养皿皿底后吸出，置超净台自然干燥后备用，用前培养液湿润。

S3：OECs的纯化：培养7天后更换条件培养液(其为全培养液加入终浓度为2×10-7mol/L的Ara-C)，培养48小时后替换为全培养液。

S4：OECs的染色鉴定：将纯化后生长良好的细胞，用常规方法进行免疫细胞化学染色。贴壁细胞去培养基，用PBS洗3次，经4％的多聚甲醛固定30min。PBS洗涤3次，0.3％TritonX-100处理20min。PBS漂洗3次，10％羊血清室温封闭20min，吸出血清，加入鼠抗人p75IgG单抗，37℃孵育2小时后PBS洗3次，加入FITC结合的羊抗鼠IgG(1∶500)孵育30m in。显色后在显微镜下观察。

本发明的分离、培养及纯化人胚嗅鞘细胞的方法，OECs经培养2～14天后仍保持雪旺细胞的双极和三极形态，细胞排布由杂乱无章，走向排列一致；采用适量的DMSO有保护轴突及髓鞘、减少水肿、促进神经周围血液流速、稳定细胞溶酶体膜和清除自由基之功效。

附图说明

通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中：

图1至图4所示为纯化后生长良好的细胞在培养生长及处理的不同阶段的显微放大图；

图5所示为本发明的分离、培养及纯化人胚嗅鞘细胞的方法流程示意图。

具体实施方式

本发明的一实施例的分离、培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法具体如下：

本实施例采用的材料和设备包括DMEM/F12、FBS(G ibco)，Forskolin、BPE、DMSO、Ara-C(Sigma)，胰酶(华美生物)，鼠抗人p75IgG单抗(S anta Curz)，FITC结合的羊抗鼠IgG(BIOSOU RCE)。解剖显微镜SXP-1B(上海医用光学仪器厂)，CO₂培养箱(SPX Corporation)，超净工作台(苏州苏净安泰公司)，倒置显微镜CK-40、荧光显微镜BX-51、数码成像系统DP-50(Olympus)。

如图5所示，所述方法步骤包括：

S1：OECs的分离培养：取2-3月龄流产胎儿，解剖显微镜下分离出两侧嗅球，移入含D-Hank’s液的培养皿，在解剖显微镜下去除毛细血管网，将嗅球最外层的嗅神经层、小球层连同包被的软膜一起剥下。用D-Hank’s液洗2次，用虹膜剪剪碎，然后用0.25％胰酶37℃消化30min，加入含血清培养液终止消化。200目滤网过滤去除大块组织，过滤液600g离心5min。弃上清，用含Forskolin和BPE的全培养液重悬，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于p75包被的培养皿。每2天换液1次。