[发明专利]一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

摘要

本发明公开了一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，将提取的hAMSCs经含10mmol/L尼克酰胺和N2补充物的无血清高糖-DMEM诱导培养基培养7天。经本发明方法诱导的hAMSCs表达胰岛素基因mRNA和PDX-1基因mRNA，培养物上清中的胰岛素含量达330μIU/ml以上，本发明方法可在体外诱导hAMSCs分化为ISCs。

主权项

一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）分离hAMSCs：将人羊膜剪成碎片，加入含0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶消化溶液，旋转消化弃上清；重新加入消化液，旋转消化弃上清，留取未消化的羊膜碎片，用D‑Hank’s液冲洗，加入含有0.075 mg/ml DNase I的0.75 mg/ml的胶原酶，旋转消化至组织完全消化，300目钢网过滤，收集细胞滤液，离心后收集细胞沉淀，即得原始hAMSCs；（2）纯化hAMSCs：将分离的原始hAMSCs重新悬浮于LG‑DMEM培养基中，以1.25×105/ml的细胞密度接种于6孔培养板，置于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的CO2，的CO2培养箱培养，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞，第3天更换新的培养基，待细胞汇合度达80~90%后，用0.25%胰蛋白酶—0.02% EDTA溶液消化2~3 分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，10离心弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮，以1×107/L的细胞密度传代；（3）鉴定hAMSCs：取第2代hAMSCs行波形蛋白和CK19免疫组织化学染色；用流式细胞仪检测CD29、CD44、CD166、 CD34和CD45；（4）诱导hAMSCs向ISCs分化：诱导分化培养基为含10mmol/L尼克酰胺和N2补充物的无血清HG‑DMEM培养基；取第2代hAMSCs用诱导分化培养基悬浮，以2.5×106个/ml细胞密度接种于6孔培养板，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2培养箱中培养7天，第三天用诱导分化培养基换液1次；hAMSCs经上述诱导分化培养其诱导培养7天即分化为ISCs；（5）ISCs的鉴定： hAMSCs诱导培养7天后，①取培养物上清液，采用放射免疫法检测胰岛素含量；② 收集部分细胞，采用逆转录‑聚合酶链反应（PT‑PCR）检测胰岛素基因mRNA和调节胰腺发育及胰岛B细胞分化的关键性转录因子胰十二指肠同源异型盒因子‑1基因mRNA的表达。