[发明专利]一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

权利要求书

1.一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）分离hAMSCs：将人羊膜剪成碎片，加入含0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶消化溶液，旋转消化弃上清；重新加入消化液，旋转消化弃上清，留取未消化的羊膜碎片，用D-Hank’s液冲洗，加入含有0.075 mg/ml DNase I的0.75 mg/ml的胶原酶，旋转消化至组织完全消化，300目钢网过滤，收集细胞滤液，离心后收集细胞沉淀，即得原始hAMSCs；

（2）纯化hAMSCs：将分离的原始hAMSCs重新悬浮于LG-DMEM培养基中，以1.25×10⁵/ml的细胞密度接种于6孔培养板，置于37°C、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂，的CO₂培养箱培养，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞，第3天更换新的培养基，待细胞汇合度达80~90%后，用0.25%胰蛋白酶—0.02% EDTA溶液消化2~3 分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，10离心弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮，以1×10⁷/L的细胞密度传代；

（3）鉴定hAMSCs：取第2代hAMSCs行波形蛋白和CK19免疫组织化学染色；用流式细胞仪检测CD29、CD44、CD166、 CD34和CD45；

（4）诱导hAMSCs向ISCs分化：诱导分化培养基为含10mmol/L尼克酰胺和N₂补充物的无血清HG-DMEM培养基；取第2代hAMSCs用诱导分化培养基悬浮，以2.5×10⁶个/ml细胞密度接种于6孔培养板，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO₂培养箱中培养7天，第三天用诱导分化培养基换液1次；hAMSCs经上述诱导分化培养其诱导培养7天即分化为ISCs；

（5）ISCs的鉴定： hAMSCs诱导培养7天后，①取培养物上清液，采用放射免疫法检测胰岛素含量；② 收集部分细胞，采用逆转录-聚合酶链反应（PT-PCR）检测胰岛素基因mRNA和调节胰腺发育及胰岛B细胞分化的关键性转录因子胰十二指肠同源异型盒因子-1基因mRNA的表达。